Kolorimetrische Detektion des Kortexabbaus während der Keimung bakterieller Sporen

Zusammenfassung

Quelle: Francis, M. B., et al. Nachweis von Kortexfragmenten während der Keimung von Bakteriensporen. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video zeigt eine kolorimetrische Methode zum Nachweis des Kortexabbaus während der Keimung bakterieller Sporen, indem die Freisetzung von reduzierenden Zuckern im Laufe der Zeit gemessen wird. Unter Verwendung von N-Acetylglucosamin-Standards und Zeitpunktproben quantifiziert der Assay die Zuckerkonzentration durch eine violette chromogene Reaktion, die das Ausmaß der Cortex-Hydrolyse anzeigt.

Protokoll

1. Farb-Reagenz

1. Während die Proben auf Eis liegen, bereiten Sie das Farbreagenz vor. 0,320 g p-Dimethylaminobenzaldehyd (DMAB; Ehrlich-Reagenz) in 1,9 ml Eisessig.
   Anmerkung: Das Reagenz ist zeit-, temperatur- und lichtempfindlich und sollte nicht im Voraus hergestellt werden.
2. Nachdem sich das DMAB vollständig aufgelöst hat, fügen Sie 100 μl 10 N HCl hinzu und wirbeln Sie es vortexen.
3. 5 ml Eisessig zugeben und vortexen.

2. Kolorimetrische Reaktion

1. Übertragen Sie 100 μl jeder gekühlten Rindeprobe in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Geben Sie 700 μl der frisch zubereiteten Farblösung zu jeder Probe.
3. Übertragen Sie die Proben sofort in ein 37 °C heißes Wasserbad und inkubieren Sie GENAU 20 Minuten.
4. Übertragen Sie 200 μl jeder Probe auf eine durchsichtige 96-Well-Platte.
5. Quantifizieren Sie die Proben bei 585 nm auf einem Platten-Reader. Die Proben sollten bei einer gelben Farbe beginnen und eine positive Reaktion wird zu violett wechseln. Je mehr Kortex vorhanden ist, desto tiefer ist die violette Farbe.

Materialien