Rekombinante Proteinproduktion und -rückgewinnung aus bakteriellen Vesikeln

Zusammenfassung

Quelle: Streather, B. R., et al. Optimierte Produktion und Analyse von rekombinanten, proteingefüllten Vesikeln aus E. coli. J. Vis. Exp. (2023)

Dieses Video zeigt die Produktion und Isolierung von rekombinanten Proteinen, die mit Vesicle Nucleating Peptide (VNp) aus bakteriellen Vesikeln markiert sind. Ein Induktor löst die Expression von VNp-markierten Proteinen aus und treibt die Vesikelbildung und -verkapselung voran, gefolgt von Zentrifugation und Beschallung für eine effiziente Proteinrückgewinnung ohne Zelllyse

Protokoll

1. Bakterielle Zellkultur und Proteininduktion

1. Um eine rekombinante Proteinexpression aus dem T7-Promotor zu induzieren, fügen Sie Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) in eine Endkonzentration von bis zu 20 μg/ml (84 μM) hinzu. Die Induktion der rekombinanten Proteinexpression muss in der Late-log-Phase (d. h. bei typischer optischer Dichte, OD₆₀₀ von 0,8-1,0) für die Produktion von Vesikeln erfolgen. ​
   ANMERKUNG: Die Länge der Induktionsphase kann zwischen den Proteinen unterschiedlich sein, wobei einige die maximale Produktion bei 4 h und andere über Nacht (18 h) erreichen. Bisher wurde der maximale Vesikelexport in Übernachtkulturen erreicht.

2. Rekombinante Vesikelisolierung

1. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3.000 x g (4 °C) für 20 min.
2. Um vesikelhaltige Medien für die Langzeitlagerung zu sterilisieren, passieren Sie die freigegebenen Nährmedien durch einen sterilen und reinigungsmittelfreien 0,45 μm Polyethersulfon (PES)-Filter.
   ANMERKUNG: Um den Ausschluss lebensfähiger Zellen aus dem vesikelhaltigen Filtrat zu testen, wird Lysogenie-Bouillon (LB)-Agar aufpoliert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
3. Um Vesikel auf ein kleineres Volumen zu konzentrieren, passieren Sie das sterile vesikelhaltige Medium durch einen sterilen und reinigungsmittelfreien 0,1 μm MCE-Mischcelluloseester (MCE)-Filter.
4. Waschen Sie die Membran vorsichtig mit 0,5-1 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einem Zellschaber oder Kunststoffspreizer, um die Vesikel vorsichtig von der Membran zu entfernen. In ein frisches Mikrofuge-Röhrchen umfüllen. ​
   ANMERKUNG: Gereinigte Vesikel können in sterilen Medien oder PBS bei 4 °C gelagert werden. Es gibt Beispiele für rekombinante Proteine, die auf diese Weise 6 Monate lang in diesen Vesikeln gelagert wurden, ohne dass die enzymatische Aktivität verloren ging.

3. Freisetzung löslicher Proteine aus isolierten Vesikeln

1. Sobald proteinhaltige Vesikel in das sterile Medium/den sterilen Puffer isoliert wurden, werden die vesikulären Lipidmembranen unter Verwendung eines geeigneten Zeitplans für das Gerät (z. B. 6x 20 s Ein- und Aus-Zyklen) einer Beschallung unterzogen und bei 39.000 x g (4 °C) für 20 Minuten zentrifugiert, um Vesikelreste zu entfernen. ANMERKUNG: Ein osmotischer Schock oder eine Detergenzienbehandlung können als Alternative verwendet werden, um die Vesikel aufzubrechen, aber die Auswirkungen auf die Proteinfunktionalität und/oder die nachgeschaltete Anwendung müssen berücksichtigt werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)	Melford	367-93-1
Lysogeny Bouillon (LB) / LB Agar	Labor-Lager	NA	10 g/l Trypton; 10 g/L NaCl; 5 g/L Hefeextrakt (1,5 g/L Agar)
MF-Millipore Membranfilter (0,1 μm, MCE)	Merck	VCWP04700
Millipore Express PLUS Membranfilter (0,45 μm, PES)	Merck	HPWP04700
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Labor-Lager	NA