F Plasmidtransfer und duale Antibiotikaauswahl in E. coli

Zusammenfassung

Quelle: Erdogan, F., et al., Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Übertragung eines F-Plasmids von Spender- auf Empfänger-E. coli-Zellen unter Verwendung eines Rettungsplasmids und der Selektion von Transkonjuganten durch duale Antibiotikaresistenz. Der Prozess umfasst das Mischen von Bakterienkulturen, die Inkubation ohne Schütteln, das Unterbrechen von Paarungspaaren und das Plattieren auf selektiven Medien, um den erfolgreichen Plasmidtransfer zu bestätigen.

Protokoll

1. Konjugativer Paarungsassay von XK1200-Spendern an MC4100-Empfänger

1. Bereiten Sie eine O/N-Kultur von XK1200 pOX38-Tc Δgen::Cm + pK184-Genzellen in 20 ml steriler Lysogenie-Bouillon (LB) mit 20 μg/ml Chloramphenicol (Cm), 50 μg/ml Kanamycin (Km) und MC4100-Zellen in 5 ml LB mit 50 μg/ml Streptomycin (Sm) unter Verwendung von Zellen aus einem Glycerinstamm oder einer einzelnen Kolonie auf einer Agarplatte und einer sterilen Pipette oder Schlaufe vor. Züchten Sie Kulturen bei 37 °C mit 200 U/min Schütteln.
2. Verdünnungen im Verhältnis 1:70 von jeder O/N-Kultur separat in 2 ml sterilem LB mit denselben Antibiotika vornehmen. Geben Sie Glukose bis zu einer Endkonzentration von 100 mM zu allen Spenderzellen. Züchten Sie die Zellen bis zur mittleren logarithmischen Phase (OD₆₀₀ 0,5-0,7) bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 200 U/min.
3. Zentrifugieren (4.000 x g für 5 min bei 4 °C), um Zellen zu pelletieren, Überstand entsorgen, einmal mit kaltem sterilem LB waschen, um Antibiotika zu entfernen, und Zellen in 2 mL kaltsterilem LB resuspendieren.
4. Aliquotieren Sie 100 μl jeder Kultur in 800 μl steriles LB-Medium und lassen Sie sie 1 h lang bei 37 °C ohne Schütteln zusammenpassen.
5. Wirbeln Sie die Zellen 30 s lang ein, um die Paarungspaare zu stören, und legen Sie sie für 10 Minuten auf Eis, um eine weitere Paarung zu verhindern.
6. Bereiten Sie unter Verwendung der vortexierten Mischung und frischer steriler LB 6 Verdünnungen (^10-2 bis ^10-7) der Transkonjugate vor. Wählen Sie für die transkonjuganten MC4100 pOX38-Tc Δgene::Cm-Zellen aus, indem Sie 10 μL Aliquots jeder Verdünnung auf jede Hälfte der Agarplatten mit 50 μg/mL Sm und 20 μg/mL Cm spotten, wie in Abbildung 1 dargestellt. Wiederholen Sie den Vorgang für beide doppelten Mischungen. Halten Sie den Bereich steril und arbeiten Sie in der Nähe einer Flamme. Die Platten O/N bei 37 °C inkubieren.

Ergebnisse

Abbildung 1: Paarungsassay zur Beurteilung der Funktion des Zielgens bei der Konjugation. Spender- und Empfängerzellen waren E. coli XK1200 pOX38-Tc ΔtraF::Cm, transformiert mit pK184-TraF bzw. MC4100. Die resu...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Petrischalen	Fisher Scientific	FB0875713
Antibiotika			Endgültige Konzentrationen
Chloramphenicol (cm)	Fisher Scientific	Nr. BP904-100	20 μg/ml
Kanamycin (km)	BioBasic Inc.	DB0286	50 μg/mL
Streptomycin (Sm)	Fisher Scientific	BP910-50	50 μg/mL