Inaktivierung von Bakterien mit lichtaktiviertem Flavin-Mononukleotid

Zusammenfassung

Quelle: Cheng, C., et al. Inaktivierung von Krankheitserregern durch Photolyse von Riboflavin-5'-Phosphat im sichtbaren Licht. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt eine Methode zur Bewertung der phototoxischen Wirkungen von Flavinmononukleotid (FMN) auf pathogene Bakterien. Bakterienkulturen werden steigenden Konzentrationen von FMN ausgesetzt und mit sichtbarem Licht beleuchtet, um reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu erzeugen, die zelluläre Komponenten schädigen. Die überlebenden Bakterien werden dann quantifiziert, um die dosisabhängige Verringerung der Lebensfähigkeit zu beurteilen.

Protokoll

1. Lebensfähigkeit von Staphylococcus aureus (S. aureus) nach FMN-Photolyse (Abbildung 1)
   1. Eine Kolonie von S. aureus (BCRC 10451) wird von einer Kulturplatte in 10 ml Lysogeny-Bouillon übertragen, die in einem 15 ml-Reagenzglas mit Schraubverschluss eingenommen wird. Kultur im Shaker bei 37°C für 16 h.
   2. Übertragen Sie 0,5 mL der Kultur in ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. Geben Sie sterilisiertes Wasser in das Zentrifugenröhrchen, um die Kultur auf eine optische Dichte von 0,5 bei 600 nm (OD₆₀₀) zu verdünnen (~6 x 10⁷ koloniebildende Einheit [KBE]/ml).
   3. 0,5 ml der Kultur in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführen, 10 Minuten lang bei 14.000 x g zentrifugieren und den Überstand dekantieren, um ein Zellpellet zu erhalten.
   4. Fügen Sie 1 ml Riboflavin-5'-phosphat (oder Flavinmononukleotid; FMN)-gepufferte Lösung (30, 60 und 120 μM FMN in Kaliumphosphatpuffer [PB]) auf die Zellpellets, die wie in Schritt 1.3 erhalten wurden, und Vortex. Für die bestrahlte Kontrolle fügen Sie 1 ml PB allein hinzu.
   5. Jeweils 1 ml lebensfähige bakterielle Zelllösungen, die nur 30 μM FMN und PB enthalten, werden in Glasröhrchen überführt und 30 min lang mit violettem Licht bei 10 W/m² bestrahlt.
   6. Jeweils 1 ml lebensfähige bakterielle Zelllösungen, die 30, 60 und 120 μM FMN und PB enthalten, werden in Glasröhrchen überführt und 120 min lang mit blauem Licht bei 20 W/m² bestrahlt. Ein weiteres Glasröhrchen mit 1 mL lebensfähiger bakterieller Zelllösung mit 120 μM FMN aufstellen und 60 min lang mit blauem Licht bei 20 W/m² bestrahlen.
   7. Stellen Sie die Reagenzgläser wie in den Schritten 1.5 und 1.6 beschrieben auf und decken Sie sie mit dicker Alufolie ab. Diese Röhren dienen als dunkle Bedienelemente.
   8. Bewahren Sie die Bestrahlungskammer (sowie die dunklen Bedienelemente) während der Bestrahlungszeit von 30-120 Minuten in einem Kühlraum bei 9 ± 1 °C auf.
      ANMERKUNG: Die von Leuchtdioden (LED) freigesetzte Wärme kann nicht ignoriert werden, da die im Becher platzierten LED-Chips das Photoreaktionssystem während der Bestrahlungsexperimente erwärmen können. Die Versuche wurden daher in einem Kühlraum durchgeführt, der bei 9 ± 1 °C gehalten wurde.
   9. Nach der Bestrahlung werden 0,2 mL aus jeder der Reaktionslösungen auf eine Luria-Agar (LA)-Platte übertragen. Die Bakterien mit einem L-förmigen Glasstab auf der Platte verteilen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
   10. Berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen Keimzellen und die Inaktivierungsraten von S. aureus nach Wachstum über Nacht.

ANMERKUNG: Die Inaktivierungsrate von S. aureus wird als prozentuale Reduktion berechnet, die gleich [1 -I / D] ×100 % ist, wobei I und D die Anzahl der KBE in der bestrahlten Probe bzw. die Dunkelkontrolle bezeichnen. Die prozentuale Reduktion ist definiert als negativer Wert der Inaktivierungsrate.

Ergebnisse

Abbildung 1: Einfluss der FMN-Photolyse auf die Lebensfähigkeit von S. aureus.Die prozentuale Reduktion ist definiert als negativer Wert der Inaktivierungsrate für S. aureus, der 120 min lang mit (<...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Blaue, grüne und rote LED-Leuchten	Vita LED Technologies Co., Tainan, Taiwan		Gleichstrom 12 V 5050
Dimethylsulfoxid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	190186
Infrarot-Thermometer	Raytek Co. Santa Cruz, Kalifornien	MT4 (Englisch)
LB Brühe	Difco Co., NJ
L-Methionin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	1.05707
NBT	Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Kanada
Stromversorgung	China tech Co., Neu-Taipeh, Taiwan	YP30-3-2
Riboflavin 5′-phosphat	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Nr. R7774
RNase	New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Solarstromzähler	Tenmars Electronics Co., Taipeh, Taiwan	TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus	Zentrum für die Sammlung und Erforschung von Bioressourcen (BCRC), Hsinchu, Taiwan	10451
Optisches UV-Vis-Spektrometer	Ocean Optics, Dunedin, FL	USB4000
UV-Vis-Spektralphotometer	Hitachi High-Tech Science Corporation, Tokio, Japan	U 2900
Violette LED	Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China