Quantifizierung der lichtinduzierten bakteriellen Inaktivierung durch Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies

Abstract

Quelle: Cheng, C., et al. Inaktivierung von Krankheitserregern durch Photolyse von Riboflavin-5'-Phosphat im sichtbaren Licht. J. Vis. Exp. (2022).

In diesem Video wird ein gepuffertes Reaktionsgemisch aus L-Methionin, Nitroblau-Tetrazolium (NBT) und Flavinmononukleotid (FMN) mit violettem Licht bestrahlt, um die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) zu induzieren. Dies führt zur bakteriellen Inaktivierung und zur Bildung von spektrometrisch nachweisbarem Formazan.

Protocol

1. Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (O₂•⁻) in Staphylococcus aureus

1. Bereiten Sie die Staphylococcus aureus-Proben vor.
2. Verdünnen Sie die Bakteriendichte der Proben mit sterilisiertem Wasser auf eine optische Dichte von 0,5 bei 600 nm (OD (Optical Density)₆₀₀, ~6 x 10⁶ CFU (Colony-forming Unit) /mL). Übertragen Sie 0,5 mL der Kultur in ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie 10 min lang bei 14.000 x g und dekantieren Sie den Überstand, um ein Zellpellet zu erhalten.
3. Fügen Sie 0,1093 g L-Methionin, 0,1 g NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) und 25 ml FMN (Flavin-Mononukleotid) (400, 240 oder 120 μM) zu 75 ml PB (Phosphatpuffer) hinzu. Für jeden 1 ml des angewendeten Reaktanten betragen die Endkonzentrationen von FMN, Methionin und NBT 100 (60 oder 30) × ^10-6 M, 7,3 × ^10-3 M bzw. 1,2 × ^10-3 M.
4. Geben Sie 1 ml jeder Reaktantenlösung (d. h. mit unterschiedlichen FMN-Konzentrationen) zu den erhaltenen Zellpellets. Bestrahlen Sie die Lösungen 10 min lang mit violettem Licht bei 10 W/m² .
5. Die Mischung bei 14.000 x g 10 min zentrifugieren und den Überstand dekantieren. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), um das reduzierte NBT zu extrahieren. Detektieren Sie die produzierte O₂•⁻-Spezies aus der Extinktion bei 560 nm.

Materials