Quantifizierung der lichtinduzierten bakteriellen Inaktivierung durch Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies

Zusammenfassung

Quelle: Cheng, C., et al. Inaktivierung von Krankheitserregern durch Photolyse von Riboflavin-5'-Phosphat im sichtbaren Licht. J. Vis. Exp. (2022).

In diesem Video wird ein gepuffertes Reaktionsgemisch aus L-Methionin, Nitroblau-Tetrazolium (NBT) und Flavinmononukleotid (FMN) mit violettem Licht bestrahlt, um die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) zu induzieren. Dies führt zur bakteriellen Inaktivierung und zur Bildung von spektrometrisch nachweisbarem Formazan.

Protokoll

1. Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (O₂•⁻) in Staphylococcus aureus

1. Bereiten Sie die Staphylococcus aureus-Proben vor.
2. Verdünnen Sie die Bakteriendichte der Proben mit sterilisiertem Wasser auf eine optische Dichte von 0,5 bei 600 nm (OD (Optical Density)₆₀₀, ~6 x 10⁶ CFU (Colony-forming Unit) /mL). Übertragen Sie 0,5 mL der Kultur in ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie 10 min lang bei 14.000 x g und dekantieren Sie den Überstand, um ein Zellpellet zu erhalten.
3. Fügen Sie 0,1093 g L-Methionin, 0,1 g NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) und 25 ml FMN (Flavin-Mononukleotid) (400, 240 oder 120 μM) zu 75 ml PB (Phosphatpuffer) hinzu. Für jeden 1 ml des angewendeten Reaktanten betragen die Endkonzentrationen von FMN, Methionin und NBT 100 (60 oder 30) × ^10-6 M, 7,3 × ^10-3 M bzw. 1,2 × ^10-3 M.
4. Geben Sie 1 ml jeder Reaktantenlösung (d. h. mit unterschiedlichen FMN-Konzentrationen) zu den erhaltenen Zellpellets. Bestrahlen Sie die Lösungen 10 min lang mit violettem Licht bei 10 W/m² .
5. Die Mischung bei 14.000 x g 10 min zentrifugieren und den Überstand dekantieren. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), um das reduzierte NBT zu extrahieren. Detektieren Sie die produzierte O₂•⁻-Spezies aus der Extinktion bei 560 nm.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dimethylsulfoxid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	190186
Infrarot-Thermometer	Raytek Co. Santa Cruz, Kalifornien	MT4 (Englisch)
LB Brühe	Difco Co., NJ
L-Methionin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	1.05707
NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid)	Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Kanada
Stromversorgung	China tech Co., Neu-Taipeh, Taiwan	YP30-3-2
Riboflavin 5′-phosphat	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Nr. R7774
Solarstromzähler	Tenmars Electronics Co., Taipeh, Taiwan	TM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureus	Zentrum für die Sammlung und Erforschung von Bioressourcen (BCRC), Hsinchu, Taiwan	10451
Optisches UV-Vis-Spektrometer	Ocean Optics, Dunedin, FL	USB4000
UV-Vis-Spektralphotometer	Hitachi High-Tech Science Corporation, Tokio, Japan	U 2900
Violette LED	Long-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China