Bestimmung der antibakteriellen Wirksamkeit eines mit Antibiotika beladenen Polymerstreifens

Zusammenfassung

Quelle: Sekar, A., et. al., Eine neuartige Methode zur Bestimmung der longitudinalen antibakteriellen Aktivität von arzneimittelfreisetzenden Materialien. J. Vis. Exp. (2023)

Dieses Video zeigt einen Lumineszenz-basierten Assay zur Beurteilung der antibakteriellen Wirksamkeit eines mit Antibiotika beladenen Polymerstreifens durch Quantifizierung der ATP-gesteuerten Lumineszenz, die in Bakterienkulturen, die dem Antibiotikum ausgesetzt sind, abnimmt.

Protokoll

Zeitabhängiger Aufbau einer Studie zur antibakteriellen Aktivität

1. Kultivieren Sie die Bakterien über Nacht in 1 ml TSB-Brühe (Tryptische Sojabrühe).
2. Verdünnen Sie die über Nacht gewachsene Bakteriensuspension auf 10⁵ KBE/ml in steriler MHB-Brühe (Mueller-Hinton-Brühe) und überprüfen Sie die lebensfähige Keimzahl mit den Lumineszenzeinheiten, bevor Sie mit dem Versuch beginnen.
3. Legen Sie die reinen UHMWPE-Streifen (Polyethylen ultrahochmolekulares Gewicht) und die mit Medikamenten beladenen UHMWPE-Streifen (3 mm x 5 mm x 10 mm) in eine 3-ml-Spritze.
4. Ziehen Sie MHB mit 10⁵ KBE/ml durch die angebrachte Nadel bis zur 1,5-ml-Markierung in die Spritze, was 1,35 mL MHB entspricht (Abbildung 1: Schritt 1).
5. Legen Sie das Spritzensetup in einen Schüttelinkubator (100 U/min) bei 37 °C bis zu den angegebenen Zeitpunkten: 6 h, Tag 1, Tag 2, Tag 3, Tag 4, Tag 5, Tag 6 und Tag 7 (Abbildung 1: Schritt 2).
6. Nehmen Sie zu jedem angegebenen Zeitpunkt die Spritze heraus und führen Sie einen Echtzeit-Viabilitätstest für die mikrobielle Lebensfähigkeit von 100 μl Bakteriensuspension durch (Abbildung 1: Schritt 3-4).
   1. Führen Sie den lumineszenzbasierten Assay mit weißen, undurchsichtigen 96-Well-Platten durch.
   2. Mischen Sie 100 μl verdünnte Bakteriensuspensionen mit 100 μl Assay-Reagenz.
   3. Legen Sie einen mit Aluminiumfolie bedeckten Deckel über die vorbereitete 96-Well-Platte und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei 100 U/min Schütteln.
   4. Messen Sie die Lumineszenz sofort mit einem Mikroplatten-Reader unter Verwendung der folgenden Einstellungen in der Gen5 3.11-Software.
      1. Klicken Sie auf Neu , um ein Protokoll im Task-Manager-Fenster einzurichten.
      2. Wählen Sie Costar 96 weiß undurchsichtig im Dropdown-Menü für Plattentyp aus.
      3. Klicken Sie auf Lesen unter dem Menü Schritte > Aktionen auswählen .
      4. Klicken Sie auf Lumineszenz im Fenster Methode lesen. Lassen Sie die Optionen Endpunkt/kinetische Faser und Lumineszenz-Faser unter Lesetyp bzw. Optiktyp ausgewählt. Klicken Sie auf OK.
      5. Behalten Sie die im Fenster Leseschritt bei (Verstärkung = 135; Integrationszeit = 1 Sek.; Lesehöhe = 4,5 mm). Klicken Sie auf OK.
      6. Das Fenster für das Plattenlayout wird für den Lauf bereit angezeigt. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Deckel verwenden im Fenster der Ladeplatte und klicken Sie auf OK.
      7. Setzen Sie die 96-Well-Platte in das Gerät ein, um die Lumineszenzwerte abzulesen.
7. Bestimmen Sie die Anzahl lebensfähiger Bakterien für die Zeitpunkte 6 Stunden, Tag 1, Tag 2, Tag 3 und Tag 7. Bestimmen Sie die KBE (Koloniebildende Einheiten)/ml aus den Lumineszenzeinheiten anhand der entsprechenden Standardkurve.
8. Überprüfen Sie die Abwesenheit lebensfähiger Bakterien in den Proben, die Lumineszenzwerte unterhalb der Nachweisgrenze aufwiesen, indem Sie die Spread-Plate-Methode auf TSA-Platten (Tryptischer Soja-Agar) durchführen und über Nacht bei 35 °C inkubieren. Überprüfen Sie am nächsten Tag, ob Kolonien vorhanden sind.
9. Die restliche Bakteriensuspension bei 10.000 × g für 10 min zentrifugieren und das verbrauchte Medium vorsichtig absaugen. Bei Röhrchen, in denen Pellets aufgrund der antibakteriellen Wirkung der Arzneimittel nicht visuell beobachtet werden, lassen Sie 100 μl in der Tube, um sicherzustellen, dass das unsichtbare Pellet nicht gestört wird (Abbildung 1: Schritt 5).
10. Suspendieren Sie die pelletierten Bakterien in frischem MHB und ziehen Sie die Bakteriensuspension durch die angebrachte Nadel in dieselbe Spritze zurück (Abbildung 1: Schritt 6).

Ergebnisse

Abbildung 1: Eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ATCC 12600	Sammlung amerikanischer Schriftkultur, VA, USA
BacTiter-Glo Mikrobieller Zellviabilitätsassay	Promega Corporation, USA	Nr. G8231
BD Bacto Tryptische Sojabrühe (Sojabohnen-Kasein-Digest Medium)	Becton-Dickinson, Vereinigte Staaten von Amerika	BD 211825	Gekauft bei Fisher Scientific, USA
BD Luer-Lok Spritze steril, Einmalgebrauch, 3 mL	BD, Vereinigte Staaten von Amerika	309657
BD Nadel 5/8 Zoll zum Einmalgebrauch, steril, 25 G	BD, Vereinigte Staaten von Amerika	305122
BD BBL Dehydrierte Nährmedien: Müller Hinton II Bouillon (kationenadjustiert)	Becton-Dickinson, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. B12322	Gekauft bei Fisher Scientific, USA
BD Difco Dehydrierte Nährmedien: Tryptischer Soja-Agar (Sojabohnen-Kasein-Digest-Agar)	Becton-Dickinson, Vereinigte Staaten von Amerika	Artikel-Nr.: DF0369-17-6	Gekauft bei Fisher Scientific, USA
Gentamicin-Sulfat	Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China
LSE Tisch-Schüttel-Inkubator	Corning, NY, Vereinigte Staaten Von Amerika
Plattenleser (Synergy H1	Biotek, VT, Vereinigte Staaten von Amerika
Schüttler Innova 2100	New Brunswick Scientific, NJ, Vereinigte Staaten von Amerika
UHMWPE	GUR1020, Celanese, TX, Vereinigte Staaten von Amerika
Vancomycin-Hydrochlorid	Fagron, Niederlande	804148