Mikrofluidische Strukturierung und fluoreszenzbasierte Verfolgung des einzelligen Bakterienwachstums

Zusammenfassung

Quelle: Pioli, R., et al., Strukturierung von Mikroorganismen und Mikropartikeln durch sequentielle Kapillaritäts-unterstützte Assemblierung. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video zeigt die Methode zum Einfangen einzelner fluoreszenzmarkierter Escherichia coli (E. coli)- Zellen in mikrofluidischen Fallen unter Verwendung einer kohlenstofffreien Suspension und eines kontrollierten Flusses, gefolgt von einer Nährstoffzugabe zur Auslösung des Wachstums und der Fluoreszenzbildgebung von Mikrokolonien.

Protokoll

1. Bakterielle Musterbildung

1. Einen Tag vor dem Experiment wurde eine Population von Escherichia coli (Stamm MG1655 prpsM-GFP) gezüchtet. Beimpfen Sie die Kultur direkt aus dem gefrorenen Bestand und züchten Sie sie über Nacht 20 Stunden lang in Lysogenie-Bouillon (LB)-Medium in einem Shaker-Inkubator bei 37 °C. Fügen Sie 50 μg/ml Kanamycin hinzu, damit die Zellen das prpsM-GFP-Plasmid (grün fluoreszierendes Protein) zurückhalten.
2. Stellen Sie den Box-Inkubator (Abbildung 1A) am Tag des Experiments einige Stunden vor dem Versuch auf 37 °C ein, um vor dem Start eine gleichmäßige und stabile Temperatur zu gewährleisten. Stellen Sie dann die Spritzenpumpe und die beheizte Glasplatte auf den Mikroskoptisch (Abbildung 1B, C) und stellen Sie die Temperatur auf die gleiche Temperatur wie im Box-Inkubator ein.
   ANMERKUNG: Der Box-Inkubator, in dem das gesamte System einschließlich des Mikroskops (Abbildung 1E) eingeschlossen ist, sorgt dafür, dass während des gesamten Experiments eine gleichmäßige und konstante Temperatur aufrechterhalten wird, wenn der Kanal mit Medium gespült wird.
3. Neunzig Minuten vor dem Experiment geben Sie den Mikrofluidik-Chip in ein Gefäß, das mit 100 % Ethanol (EtOH) gefüllt ist, und spülen Sie den Kanal mindestens 10 Minuten lang mit 100 % EtOH. Legen Sie den mikrofluidischen Chip in einen Vakuumexsikkator und entgasen Sie ihn für mindestens 30 Minuten. Tauschen Sie das EtOH gegen destilliertes Wasser aus und vakuumieren Sie den Chip für mindestens 30 Minuten. Legen Sie den Mikrofluidik-Chip für 10 Minuten bei 70 °C in den Ofen, um alle im Kanal verbliebenen Flüssigkeitsreste zu entfernen.
   ANMERKUNG: Dieser Schritt ist notwendig, um die Blasenbildung im Kanal zu verhindern, wenn er mit Nährmedium gespült wird.
4. 1 ml 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS)-Medium (1x) in ein Zentrifugenfläschchen pipettieren und 10 μl 0,132 M Kaliumphosphat (K₂HPO₄) zugeben. Nehmen Sie die Übernachtkultur aus dem 37 °C Inkubator und aliquotieren Sie 100 μl in das Zentrifugenfläschchen und zentrifugieren Sie die Kultur bei 2.300 × g für 2 min. Pipettieren Sie den Überstand vorsichtig aus den Zentrifugenfläschchen und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml frischem MOPS-Medium mit 0,015 % v/v Tween 20 und 0,01 % v/v Kaliumphosphat.
   ANMERKUNG: Die typische Konzentration der Bakteriensuspension liegt im Bereich von 0,015-0,15 Vol.-%, was die Bildung einer ausgedehnten und beweglichen Akkumulationszone gewährleistet und die Ansammlung von Partikeln auf dem Substrat verhindert. Der Ersatz des Overnight-Mediums durch frisches Medium minimiert das Risiko, dass Bakterienfilme auf der Schablone freigesetzt werden. Das Fehlen einer Kohlenstoffquelle im frischen Medium verhindert, dass Zellen während der Template-Strukturierung in der Suspension wachsen. Eine Konzentration von 0,015 % v/v Tween 20 in der Suspension ist notwendig, damit der Kontaktwinkel der zurückweichenden Flüssigkeit auf der PDMS-Vorlage in den optimalen Bereich zwischen 30 und 60° fällt.
5. Laden Sie die Bakteriensuspension in eine 1-ml-Spritze und verbinden Sie die Spritze durch einen mikrofluidischen Schlauch mit dem Chip.
   1. Um die Verbindung zwischen Spritze und Schlauch zu sichern, führen Sie eine Nadel mit einem Außendurchmesser von 0,6 mm direkt in den Schlauch ein. Um zu vermeiden, dass Suspensionen, die in der Nähe des Einlasses verbleiben, über den Kanal verstreut werden, spülen Sie frisches Medium durch das Loch, das während des Strukturierungsprozesses als Auslass verwendet wurde (Abbildung 2A-III), und nicht durch das Loch, das als Einlass verwendet wird.
   2. Montieren Sie die Spritze auf der Spritzenpumpe und injizieren Sie die Suspension durch den Einlass im stromaufwärts gelegenen Teil des Kanals in den Mikrofluidikchip, bis die Suspension den Schablonenbereich mit Fallen bedeckt. ANMERKUNG: Während des Flüssigkeitseinspritzvorgangs kann Luft durch einen Auslass entweichen, der sich am stromabgewandten Ende des Kanals befindet.
   3. Stellen Sie die Spritzenpumpe so ein, dass sie die Bakteriensuspension (Abbildung 2A-I) bei einer Durchflussrate von 0,07-0,2 μl/min absaugt, was in der beschriebenen Geometrie einer Meniskuszurückweichgeschwindigkeit von 80-100 μm/min entspricht.
   4. Überwachen Sie den Strukturierungsprozess über eine Mikroskopsoftware.
      ANMERKUNG: Hier wurde eine 10-fache Vergrößerung verwendet, um den zurückweichenden Meniskus auf der Schablone zu überwachen, und eine 20-fache Vergrößerung wurde verwendet, um die Ablagerung einzelner Bakterien in die mikrofabrizierten Fallen zu überwachen.
6. Nachdem die Schablone mit Zellen strukturiert wurde (Abbildung 2A-II), erhöhen Sie die Entnahmeflussrate, um den mikrofluidischen Kanal schnell zu entleeren und ihn mit frischem LB zu spülen, das zuvor mindestens 30 Minuten lang entgast und auf 30 °C vorgewärmt wurde.
7. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf eine Durchflussrate von 2 μl/min ein, um den Kanal sanft zu spülen. Sobald der Kanal gefüllt ist, erhöhen Sie die Durchflussrate (15 μL/min) entsprechend den spezifischen experimentellen Anforderungen.
8. Nehmen Sie Bilder von wachsenden Bakterien in der gewünschten Vergrößerung und im gewünschten Zeitintervall auf.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Plattform für die sequentielle kapillaritätsgestützte Assemblierung in einem mikrofluidischen Kanal. (A) Box-Inkubator. Der Box-Inkubator hält eine gleichmäßige und konstante Temperatur (hier 30 °C) ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BD 10 mL Spritze (Luer-Lock)	BD	300912	Wird verwendet, um frische Lysogeny-Brühe in den mikrofluidischen Kanal zu spülen
Box-Inkubator	Life Imaging Dienstleistungen		Wird verwendet, um eine gleichmäßige und konstante Temperatur im Kanal zu gewährleisten
Zentrifuge	Eppendorf	5424R	Wird verwendet, um die Overnight-Medien durch frische Minimalmedien zu ersetzen
Fläschchen für Zentrifuge	Eppendorf	30120086	1,5 mL
CETONI Basis 120	CETONI GmbH		Spritzenpumpe
H401-T-REGLER	Okolab		Steuerung der beheizten Glasplatte
H601-NIKON-TS2R-GLAS	Okolab		Beheizte Glasplatte
Insulinspritzen, U 100, mit Luer	Codan Medizin ApS	CODA621640	1 mL Spritze, die zum Entnehmen der flüssigen Suspension während des Strukturierungsprozesses verwendet wird
LB Broth, Müller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	244610	Lysogenese-Brühe, die in den mikrofluidischen Kanal gespült wird
Masterflex Transfer-Schlauch	Masterflex	HV-06419-05	0,020'' Innendurchmesser, 0,06'' Außendurchmesser
MOPS (10-fach)	Teknova	Nr. M2101	Zehnfach mit milliQ Wasser verdünnt und als Ersatz für das Overnight-Medium verwendet
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instrumente		Mikroskop
Kaliumphosphat zweibasisch	Sigma Aldrich	Nr. P3786	Zu MOPS 1x hinzugefügt
Tween 20	Sigma Aldrich	Nr. P1379	Wird verwendet, um einen optimalen Rückzugswinkel während des Strukturierungsprozesses zu gewährleisten