Bakterieller Biosensor-Assay zum Nachweis von bioverfügbarem Quecksilber unter anaeroben Bedingungen

Zusammenfassung

Quelle: Stenzler, B. R. et. al., Ein anaerober Biosensor-Assay zum Nachweis von Quecksilber und Cadmium. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt den Einsatz von gentechnisch veränderten bakteriellen Biosensoren, um den bioverfügbaren Anteil von Quecksilberionen unter anaeroben Bedingungen genau zu messen. Durch Variation der Konzentration von Magnesiumsulfat stellt der Assay sicher, dass der Biosensor selektiv auf freie Quecksilberionen reagiert, was sich in Änderungen der Fluoreszenzintensität zeigt.

Protokoll

1. Expositions-Assay

1. Entwerfen eines Plattenlayouts.
   ANMERKUNG: Stellen Sie sicher, dass Sie alle Pipettierwerte berechnet und die Vorräte vorbereitet haben, bevor Sie mit dem Expositionstest beginnen. Wie man ein Experiment richtig entwirft und welche Steuerelemente einbezogen werden sollen, wird im Text ausführlich beschrieben. Darüber hinaus sollte der Versuch nicht gestartet werden, wenn sich Sauerstoff in der anaeroben Kammer befindet, die auf dem anaeroben Monitor angezeigt wird.
2. Entwerfen Sie das Plattenlayout nach einer 96-Well-Vorlage. Auf diese Weise können 32 verschiedene Behandlungen durchgeführt werden, um Experimente in technischen Replikaten von 3 durchzuführen, was am besten durch ein 4 x 8-Raster zum Aufstellen von Fläschchen dargestellt wird (siehe Abbildung 1).

ANMERKUNG: Bei der Prüfung der Rolle einer Variablen für die Hg-Aufnahme mit dem Quecksilber-induzierbaren Biosensor sind für jede Variable zwei Behandlungen erforderlich: die Behandlung (Biosensor + Quecksilber (Hg) + Variable + Nitrat) und ihr Behandlungsrohling (Biosensor + Variable + Nitrat). Bei der Prüfung der Rolle einer Variablen auf die Physiologie der Zelle mit dem konstitutiven Biosensor sind für jede Variable zwei Behandlungen erforderlich: die Behandlung (Biosensor + Hg + Variable + Nitrat) und der Behandlungsblindwert (Biosensor + Variable + Hg). Quecksilber kann durch Cadmium (Cd) ersetzt werden. Hg oder Cd wird zur Variablen, wenn eine Kalibrierkurve durchgeführt wird. Die konstitutiven und induzierbaren Biosensoren müssen nicht gleichzeitig (im gleichen Plattenlayout) betrieben werden. Ein Vorlagenbeispiel für das Plattenlayout und das entsprechende 4 x 8-Raster bei der Prüfung eines Konzentrationsbereichs von Magnesium (variabel) ist in Tabelle 1 enthalten.

2. Richten Sie das 4 x 8-Raster entsprechend dem Layout der Assay-Platte ein.

1. Legen Sie 7 ml Standardfläschchen aus Polytetrafluorethylen (PTFE) in die Schale.
ANMERKUNG: PTFE-Fläschchen sollten vor der Verwendung mit Säure gewaschen oder heißsterilisiert werden. Sie sollten nur durch Manipulation der Außenseite der Durchstechflasche gehandhabt werden.

2. Geben Sie zu jeder Durchstechflasche das Expositionsmediumvolumen , das jeder Behandlung entspricht.
ANMERKUNG: Bei einer Exposition mit einem Gesamtvolumen von 2.000 μl (2 ml) beträgt das hinzugefügte Expositionsmedium : Expositionsmedium μL = 2.000 μL – Behandlung (leer) μL. (z. B. Expositionsmedium μL = 2.000 – 100 μL (Biosensor) – 40 μL (Nitrat) – 100 μL (Hg) – 100 μL (variabel (z. B. Magnesiumsulfat, MgSO₄)) = 1660 μL). Es ist sicherzustellen, dass das hinzugefügte Volumen der getesteten Variablen 5 % (100 μl) des endgültigen Volumens nicht überschreitet.

3. Geben Sie das entsprechende Volumen der Lösung der zu prüfenden chemischen Variablen entsprechend der Plattenanordnung in jede Durchstechflasche.

4. Geben Sie Nitrat in jede Durchstechflasche, so dass die Endkonzentration 200 μM (40-80 μL) beträgt. Schließen Sie diesen Schritt für konstitutive Rohlinge für die Biosensorbehandlung aus.

5. Geben Sie Hg (5 nM bei der Prüfung auf eine Variable) oder Cd (300 nM bei der Prüfung auf eine Variable) entsprechend der Plattenanordnung zu den Fläschchen. Schließen Sie diesen Schritt für quecksilberinduzierbare Biosensor-Behandlungsrohlinge aus.

1. Wenn Sie Hg verwenden, nehmen Sie das 4-8 μM Vorratsmaterial und schütteln Sie es gut. Verdünnen Sie die Lösung in einem 7-ml-PTFE-Fläschchen in einem 7-ml-Fläschchen auf 100-250 nM , um eine funktionierende Hg-Lösung herzustellen. Geben Sie aus dieser Arbeitslösung Hg in die erforderlichen Durchstechflaschen. In diesem Fall wird eine Kalibrierkurve von Hg im Bereich von 0 bis 12,5 nM verwendet.
ANMERKUNG: Wenn Sie die Wirkung einer Variablen auf die Hg- oder Cd-Bioverfügbarkeit testen, stellen Sie sicher, dass [Hg] oder [Cd] über alle Behandlungen hinweg konstant bleibt. Achten Sie beim Hinzufügen von Hg oder Cd darauf, eine Pipettenspitze zu verwenden, aber berühren Sie niemals das Expositionsmedium in den Fläschchen.

Manuelles Schütteln in einer Orbitalbewegung.
ANMERKUNG: Der Versuch kann jetzt unterbrochen werden, abhängig von der Zeit, die Hg oder Cd benötigt, um in Lösung zu spezifizieren. Wenn Sie es länger als eine Stunde stehen lassen, setzen Sie PTFE-Kappen auf die PTFE-Fläschchen, um Verdunstung/Kontamination zu verhindern.

Pipettieren Sie den Biosensor-Schaft vorsichtig hin und her, um die Homogenität zu gewährleisten. Geben Sie 100 μl Biosensor-Schaft in jedes Fläschchen. Orbital manuell schütteln.

Bereiten Sie den Plattenleser so vor, dass er sich aufwärmt, um die folgenden Kriterien zu erfüllen: Temperatur bei 37 °C, kinetischer Lauf für 10 Stunden mit Messvorgängen alle 2,5 bis 5 Minuten mit orbitalem Schütteln zwischen den Lesevorgängen und Fluoreszenzmessungen mit einer Fluoreszenzanregung von 440 nm und einer Emission von 500 nm.

Pipettieren Sie 200 μl aus jedem PTFE-Fläschchen im 4 x 8-Gitter in die entsprechenden Vertiefungen der 96-Well-Platte (Schwarz, 96-Well-Mikrotiterplatten mit klarem Boden, nicht bindende Oberfläche). Pipettieren Sie fünfmal hin und her, bevor Sie jeweils 200 μl umfüllen.HINWEIS: Anstatt die Pipettenspitze zu entsorgen, lassen Sie die Pipettenspitze in der PTFE-Durchstechflasche, um den Pipettierfortschritt zu verfolgen.

Legen Sie die 96-Well-Platte in das Fach des Plattenlesegeräts, setzen Sie dann den Deckel auf die 96-Well-Platte und beginnen Sie mit dem Assay.

 

Tabelle 1: Ein Beispiel für ein Plattenlayout für die Verwendung des Biosensors zur Messung der Hg-Bioverfügbarkeit (5 nM) über einen Gradienten von Magnesium (0-10 mM)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

ein

Hg induzierter Biosensor + Hg + Nitrat + 0 mM Mg

Hg induzierter Biosensor + Nitrat + 0 mM Mg

Konstitutiver Biosensor + Hg + Nitrat + 0 mM Mg

Konstitutiver Biosensor + Hg + 0 mM Mg

b

Hg induzierter Biosensor + Hg + Nitrat + 0,1 mM Mg

Hg induzierter Biosensor + Nitrat + 0,1 mM Mg

Konstitutiver Biosensor + Hg + Nitrat + 0,1 mM Mg

Konstitutiver Biosensor + Hg + 0,1 mM Mg

c

Hg induzierter Biosensor + Hg + Nitrat + 1 mM Mg

Hg induzierter Biosensor + Nitrat + 1 mM Mg

Konstitutiver Biosensor + Hg + Nitrat + 1 mM Mg

Konstitutiver Biosensor + Hg + 1 mM Mg

d

Hg induzierter Biosensor + Hg + Nitrat + 10 mM Mg

Hg induzierter Biosensor + Nitrat + 10 mM Mg

Konstitutiver Biosensor + Hg + Nitrat + 10 mM Mg

Konstitutiver Biosensor + Hg + 10 mM Mg

Materialien