Screening von Inhibitoren der bakteriellen membrangebundenen Pyrophosphatase mit einem kolorimetrischen Assay

Zusammenfassung

Quelle: Vidilaseris, K., et al. Screening auf thermotoga maritima membrangebundene Pyrophosphatase-Inhibitoren. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt einen kolorimetrischen Assay zum Screening von Inhibitoren der bakteriellen membrangebundenen Pyrophosphatase (mPPase) durch Quantifizierung der Orthophosphatfreisetzung. Die Methode ermöglicht die Identifizierung von Verbindungen, die die mPPase aus Thermotoga maritima, einem potenziellen antimikrobiellen Wirkstoffziel, hemmen.

Protokoll

1. Reagenzien für die Assay-Vorbereitung

1. Bereiten Sie die Arsenit-Citrat-Lösung vor.
   1. Wiegen Sie 5 g Natriumarsenit und 5 g Trinatriumcitratdihydrat.
      VORSICHT: Natriumarsenit ist giftig; Verwenden Sie daher die richtige Schutzausrüstung und gehen Sie mit besonderer Vorsicht vor. Als Vorsichtsmaßnahme nicht anfassen, bevor alle notwendigen Sicherheitsvorkehrungen gelesen und verstanden wurden. Nur in einem Abzug anfassen, um keinen Staub/Dämpfe der Verbindung oder ihrer Lösung(en) einzuatmen. Wenn Sie es einatmen, gehen Sie an die frische Luft und suchen Sie einen Arzt auf. Tragen Sie eine geeignete Schutzbrille, Schutzhandschuhe und Kleidung, um Verschlucken und Augen-/Hautkontakt zu vermeiden. Bei Verschlucken sofort ein Giftinformationszentrum oder einen Arzt anrufen. Wenn es auf die Haut oder in die Augen gelangt, waschen Sie es mit viel Wasser und suchen Sie einen Arzt auf.
   2. In 100 mL Wasser auflösen.
   3. Fügen Sie 5 ml Eisessig hinzu, mischen Sie und fügen Sie Wasser zu 250 ml hinzu.
   4. Bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt lagern.
      ANMERKUNG: Die Lösung ist mehr als ein Jahr lang stabil.
2. Bereiten Sie Lösung A und Lösung B vor.
   1. Für Lösung A werden 10 ml eiskalte 0,5 M HCl (Salzsäure) zu 0,3 g Ascorbinsäure hinzugefügt. Die Ascorbinsäure durch Vortexen auflösen.
   2. Für Lösung B 1 ml eiskaltes Wasser zu 70 mg Ammoniumheptamolybdat-Tetrahydrat hinzufügen und zum Auflösen einwirbeln.
      ANMERKUNG: Bewahren Sie beide Lösungen bis zur Verwendung auf Eis auf. Um die Konsistenz des Untersuchungsergebnisses zu gewährleisten, können beide Lösungen maximal eine Woche auf Eis gelagert werden.
3. Bereiten Sie den Phosphat (Pi)-Standard mit einer Konzentration von 0 μM, 62,5 μM, 250 μM und 500 μM für die Kalibrierung vor.
   1. 0 μl, 25 μl, 50 μl und 100 μl 5 mM Na₂HPO₄ (Dinatriumphosphat)-Dihydrat werden in vier Mikroröhrchen mit 370 μl des Reaktionsgemisches gegeben.
   2. Füllen Sie bis zu 1 mL mit Wasser auf.

2. Aktivitätsassay für eine 96-Well-Platte

ANMERKUNG: In Abbildung 1 sehen Sie den schematischen Ablauf des Assays.

1. 1 ml Lösung B zu 10 ml Lösung A hinzufügen, durch Vortexen mischen und die Lösung auf Eis lagern.
   ANMERKUNG: Diese Lösung sollte transparent und gelb sein. Bewahren Sie Lösung A + B vor der Verwendung mindestens 30 Minuten auf Eis auf. Verwenden Sie die Lösung jedoch innerhalb von 3 Stunden, da sie nach längerer Lagerung schlecht wird.
2. Geben Sie 40 μl 0 μM, 62,5 μM, 250 μM und 500 μM Pi Standard in dreifacher Ausfertigung mit einer Mehrkanalpipette zu den Röhrchenstreifen.
   ANMERKUNG: Das Reaktionsgemisch ohne Zugabe von Pi wird als Blindwert verwendet.
3. Geben Sie 25 μl Verbundlösung mit einer Mehrkanalpipette zu den Röhrchenstreifen.
   ANMERKUNG: Jede Verbindung hat drei verschiedene Konzentrationen in dreifacher Ausfertigung, was für eine erste Abschätzung der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) ausreicht. Für eine genauere IC50-Bestimmung können acht verschiedene Verbindungskonzentrationen verwendet werden. Für das ungehemmte Enzym wird die Verbindungslösung durch die gleiche Menge Wasser ersetzt. Als Positivkontrollen wurden 2,5 μM, 25 μM und 250 μM Imidodiphosphat (IDP)-Natriumsalz verwendet.
4. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 15 μl mPPase-Lösungsgemisch (membrangebundene Pyrophosphatase) zu den Röhrchenstreifen (mit Ausnahme der Röhrchen mit Pi-Standard).
5. Verschließen Sie die Rohrstreifen mit einer selbstklebenden Dichtungsfolie. Schneiden Sie die Dichtungsfolie ab, um die einzelnen Rohrstreifen zu trennen.
6. Inkubieren Sie die Proben 5 Minuten lang bei 71 °C vor. Legen Sie die Proben mit einem Abstand von 20 s zwischen den einzelnen Streifen auf den Heizblock, um den Zeitaufwand während der nachfolgenden Schritte zu minimieren.
7. Öffnen Sie für jeden Streifen die Klebedichtung. Mit einer Mehrkanalpipette werden 10 μl 2 mM dibasisches Natriumpyrophosphat zugegeben und durch Auf- und Abpipettieren für 5× gemischt. Verschließen Sie den Rohrstreifen erneut mit der gleichen Dichtung.
   ANMERKUNG: Dieser Schritt kann zunächst in 20 s schwierig zu bewerkstelligen sein; Nach einigen Assays wird es jedoch einfacher.
8. Bei 71 °C 5 min inkubieren.
9. Die Proben werden im Abstand von 20 s zwischen den einzelnen Streifen auf das Kühlgerät gelegt. Lassen Sie sie 10 Minuten abkühlen, zentrifugieren Sie jedoch jeden Streifen kurz nach 5 Minuten Abkühlung, um Wassertropfen unter die Dichtungsfolie zu dekantieren, legen Sie sie dann wieder in die Kühlvorrichtung und entfernen Sie die Dichtung.
   ANMERKUNG: Die Kühlvorrichtung kann einfach hergestellt werden, indem eine 96-Well-PCR-Platte (Polymerase-Kettenreaktion) auf eine mit Wasser gefüllte und mindestens 1 h eingefrorene Petrischale aus Polystyrol (Größe 150 mm × 15 mm) gelegt wird. Das Gerät sollte etwa 5 Minuten vor Beginn des Assays aus dem Gefrierschrank genommen werden. Nehmen Sie das Kühlgerät nicht unmittelbar vor dem Abkühlen der Probe heraus, da dies das Reaktionsgemisch einfriert und die Farbentwicklung behindert.
10. Nach 10 min Abkühlung 60 μl Lösung A + B hinzufügen, durch Auf- und Abpipettieren 5 × mischen und die Röhrchenstreifen 10 Minuten lang auf dem Kühlgerät belassen.
11. 90 μl der Arsenit-Citrat-Lösung zugeben und mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahren, um eine stabile blaue Farbe zu erhalten.
    VORSICHT: Aufgrund seiner Toxizität sollten alle Lösungen, die Natriumarsenit enthalten, jederzeit mit besonderer Sorgfalt behandelt werden. Daher sollte die Zugabe von Arsenit-Citrat-Lösung in einem Abzug erfolgen.
12. Geben Sie 180 μl jedes Reaktionsgemisches in eine durchsichtige 96-Well-Mikroplatte aus Polystyrol.
13. Messen Sie die Extinktion jeder Vertiefung bei 860 nm mit einem Mikroplatten-Spektralphotometer.

Ergebnisse

Abbildung 1: Ein schematischer Arbeitsablauf des TmPPase-Inhibitionsassays in einem 96-Well-Plattenformat. Die rote Nummerierung zeigt die Schritte des Assays gemäß dem Protokoll an, und die blauen Pfeile zeigen die Reihenfolge der Intervall...

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