Visualisierung von Keimproteinen in der inneren Membran von Bakteriensporen

Zusammenfassung

Quelle: Wen, J., Pasman, et. al., Visualisierung von Germinosomen und der inneren Membran in Bacillus subtilis-Sporen . J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die Verwendung von strukturierter Beleuchtungsmikroskopie, um dreidimensionale Fluoreszenzbilder zu erhalten, die die Organisation von Keimproteinen innerhalb der Bakterienspore zeigen.

Protokoll

1. Keimprotein-Bildgebung (Zeit: 1 h)
   1. Erfassen Sie die Transmissions- und Fluoreszenzbilder von Sporen sowie einer Mischung aus roten und gelb-grünen Carboxylat-modifizierten fluoreszierenden Mikrosphären auf einem Mikroskop mit strukturierter Beleuchtung (siehe Materialtabelle), das mit einem 100-fachen Ölobjektiv (numerische Apertur = 1,49), einer CCD-Kamera (Charge-Coupled Device) und einer Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle) ausgestattet ist). Erzeugen Sie alle Bilder bei Raumtemperatur ohne Störung durch Umgebungslicht. Achten Sie darauf, das 100x-Objektiv und den Objektträger vor der Bildgebung immer mit 75% Ethanol zu reinigen.
   2. Fokussieren Sie sich auf fluoreszierende Mikrosphären mit einem Durchmesser von 100 nm und optimieren Sie die Punktspreizfunktion (PSF), indem Sie den Korrekturring am 100x-Objektiv anpassen, bis eine symmetrische PSF erreicht wird, wodurch die Unschärfe des Bildes minimiert wird. Die psf ist die Impulsantwort oder die Reaktion eines abbildenden Systems auf eine Punktquelle oder ein Punktobjekt.
   3. Wählen Sie ein Sichtfeld mit ca. 10 runden fluoreszierenden Mikrosphären. Wenden Sie eine Gitterfokuseinstellung für die Anregungswellenlängen von 561 nm und 488 nm als Leitfaden für die Bildanalysesoftware an.
   4. Fokussieren Sie die Sporen mit dem Transmissionslicht und nehmen Sie ein Transmissionslichtbild im 16×Average-Modus mit einer Belichtungszeit von 200 ms für jedes Bild auf.
   5. Nehmen Sie 3D-SIM-Rohfluoreszenzbilder der Sporen mit dem Beleuchtungsmodus "3D-SIM" auf, die Kameraeinstellungen auf den Auslesemodus Elektronenmultiplikation (EM) Verstärkung 10 MHz bei 14 Bit und EM-Verstärkung bei 175. Stimulieren Sie die FM4-64-Sonde in PS4150-Sporen mit 561 nm Laserlicht bei 20 % Laserleistung und einer Beleuchtungszeit von 400 ms.
   6. Stimulieren Sie die GerKB-mCherry und GerD-GFP in KGB80-Sporen mit 561 nm Laserlicht bei 30 % Laserleistung für 1 s bzw. 488 nm Laserlicht bei 60 % Laserleistung für 3 s. Die Z-Stack-Einstellungen befinden sich im Top-to-Bottom-Modus, 0,2 μm/Schritt.
      ANMERKUNG: Diese Laserparameter wurden angewendet, um einen maximalen Helligkeitswert von etwa 4.000 für das Histogrammfenster zu gewährleisten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Luftgetrocknete Objektträger aus Glas	Menzel Gläser	630-2870
APO TIRF N20R8 100× Öl-Objektiv (NA=1,49)
Bacillus subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
Bacillus subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
FluoSpheres Carboxylat-modifizierte Mikrosphären	Invitrogen, 0,1 μm	Nr. F8803
FM4-64	Thermo Fisher Scientific	Nr. F34653
Histodenz nichtionischer Dichtegradient mittel	Sigma-Aldrich	Nr. D2158
Bild J
iXON3 DU-897 X-6515 CCD-Kamera	Andor-Technologie		https://imagej.net/Welcome
Software für die Bildgebung von Mikroskopen	Nikon, Japan	NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrareines entminilztes Wasser	Millipore	Milli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti Mikroskop
Präzisions-Deckgläser	Paul Marienfeld	117650
Röhrchen mit Schraubverschluss 50 mL	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM