Transfektion von Wildtyp-Amöben mittels Elektroporation mit bakterieller Fütterungsunterstützung

Zusammenfassung

Quelle: Paschke, P., et al. Gentechnik von Dictyostelium discoideum-Zellen basierend auf Selektion und Wachstum auf Bakterien. J. vis. exp. (2019).

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Einführung eines Plasmids, das ein Zielgen trägt, in Amöbenzellen mittels Elektroporation, gefolgt von der Rückgewinnung in einem bakteriellen Ergänzungsmittel, um eine effiziente Genabgabe in Wildtyp-Amöben zu ermöglichen.

Protokoll

1. Einrichten von Dictyostelium-Zellen für die Transfektion
   1. Züchten Sie Klebsiella aerogenes über Nacht bei RT (Raumtemperatur) bis zum Zusammenfluss in SM (Magermilch) Medium (nährstoffreiches Medium). Die Kulturen können bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
   2. Geben Sie etwa 400 μl dieser bakteriellen Suspension auf eine SM-Agarplatte (Pepton 10 g/L; Hefeextrakt 1 g/L; Glukose 10 g/L; KH₂PO₄ 1,9 g/L; K₂HPO₄ x 3 H₂Ø, 1,3 g/L; MgSO₄ wasserfrei 0,49 g/L; 1,7% Agar) und gleichmäßig verteilen. Nehmen Sie eine sterile Schlaufe und impfen Sie mit Dictyostelium-Zellen . Verteilen Sie die Zellen an einer Kante der Platte.
   3. Inkubieren Sie die Platte 2 Tage lang bei 22 °C, um ausreichend große Wachstumszonen für die Transfektion zu gewährleisten.
      ANMERKUNG: Für Dictyostelium-Stämme , die keine großen Wachstumszonen bilden (z. B. Ax3, DH1 oder JH10), oder für unerfahrene Experimentatoren, verwenden Sie stattdessen Reinigungsplatten.
   4. Nehmen Sie eine sterile Schlaufe und impfen Sie mit Dictyostelium-Zellen (ca. 2-4 x 10,⁵ Zellen). Die Zellen werden in 800 μl einer dichten K. aerogenes-Suspension in SM überführt. Mischen Sie die Zellen durch Auf- und Abpipettieren.
   5. Übertragen Sie 400 μl, 200 μl, 100 μl und 50 μl auf frische SM-Agarplatten. Zu jeder Platte 400 μl zusätzliche SM K. aerogenes-Suspension geben, gleichmäßig verteilen und trocknen.
   6. Inkubieren Sie die Platten bei 22 °C für ca. 2 Tage, bis die Platten durchscheinend sind.
      ANMERKUNG: Aufgrund ihrer schnelleren Wachstumsrate produzieren die Bakterien zunächst einen konfluenten Rasen, und die Amöben "reinigen" anschließend die Platte von den Bakterien. Die Zeit, die für diesen Prozess benötigt wird, kann je nach Stammhintergrund und der Fähigkeit der mutierten Zellen, auf Bakterien zu wachsen, variieren.

2. Transfektion von Dictyostelium-Zellen auf der Grundlage von Bakterienselektion

1. Zur Herstellung von Platten mit K. aerogenes-Suspension werden 10 ml SorMC-Puffer mit K . aerogenes-Bakterien mit einer Dichte von OD (Optische Dichte)₆₀₀ = 2 (200 μl der vorbereiteten OD₆₀₀ = 100 K. aerogenes-Stammlösung für die gewünschte Bakterienkonzentration zugegeben) in eine 10 cm große, mit Gewebekultur behandelte Petrischale gegeben.
   ANMERKUNG: Diese Platte wird später benötigt, um die transfizierten D. discoideum-Zellen zu kultivieren. Alternativ kann eine 6-Well-Gewebekulturplatte verwendet werden. Im Falle der Transfektion der extrachromosomalen Plasmide ist die 6-Well-Gewebekulturplatte ressourcenschonender. Verwenden Sie 2 ml K . aerogenes SorMC-Suspension (OD₆₀₀ = 2) pro Vertiefung.
2. Aufbereitung von Dictyostelium-Zellen
   1. Kratzen Sie mit einer 10-μl-Einweg-Impfschlaufe Zellen aus den Wachstumszonen (ca. 3 cm) der Kulturplatte (Rand des freigelegten Bereichs) oder der Reinigungsplatte ab. Übertragen Sie die Zellen in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml eiskaltem H40-Puffer.
      ANMERKUNG: Der Zeitpunkt der Entnahme von Zellen aus den Clearingplatten ist entscheidend. Eine zu frühe Ernte liefert eine zu geringe Menge an Zellen, während eine zu späte Ernte das Risiko erhöht, teilweise entwickelte Zellen zu erhalten.
   2. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 2 Minuten lang bei 1.000 x g herunterschleudern oder 2 s lang bei 10.000 x g flashen. Den Überstand verwerfen und die Zellen in H40-Puffer auf eine endgültige Dichte von 2-4 x 10⁷ Zellen/ml resuspendieren. Halten Sie die Zellen während des gesamten Transfektionsvorgangs kalt. Verwenden Sie eine Eis-Wasser-Aufschlämmung, um den direkten Kontakt der Rohre mit dem Eis zu gewährleisten.
3. Elektroporation
   1. Geben Sie 100 μl Zellen in ein Röhrchen mit 1-2 μg DNA (Desoxyribonukleinsäure). Vorsichtig mischen, indem Sie auf und ab pipettieren.
   2. Das Zell-DNA-Gemisch in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette (2 mm Abstand) überführen.
   3. Pulsieren Sie die Zellen mit den folgenden Rechteckwelleneinstellungen: 350 V, 8 ms, 2 Impulse und 1 s Impulsintervall.
      ANMERKUNG: Fügen Sie nicht mehr als 2 μg DNA hinzu. Höhere Mengen sind toxisch für die Zellen und verringern die Transfektionseffizienz. Das zugeführte Gesamtvolumen der DNA sollte 5 μl nicht überschreiten.
   4. Die Zellen werden sofort in die zuvor vorbereitete 10 cm Petrischale mit K. aerogenes SorMC überführt und die Zellen 5 h lang erholen können.
      ANMERKUNG: Kontrollieren Sie die Zellen in der Petrischale unter einem inversen Mikroskop. Die Zellen erscheinen direkt nach der Elektroporation rund, kehren aber nach etwa 30 Minuten in ihre amöboide Form zurück, wenn sie genügend Zeit hatten, sich richtig an der Oberfläche zu befestigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Eppendorf Mikrozentrifugen 5424/5424R	ThermoScientific	05-400-002
Eppendorf 5702R Zentrifugen mit Rotor Modell A-4-38	ThermoScientific	12823252
Sicherheitswerkbank Foruna - SCANLAF	Labogene
BioPhotometer Plus	Eppendorf
CLSM 710	Zeiss
Gereinigter Agar	Oxoid	Nr. LP0028
SM Brühe	Für mittel	SMB0102
2x LB Brühe	Für mittel	LBD0102
HEPES-freie Säure	Sigma Aldrich/Merck	391340 EMD
KH₂PO₄	VWR	Nr. P/4800/53
Na₂HPO₄ 2H₂O	VWR	10028-24-7
MgCl₂ 6H₂O	Sigma Aldrich/Merck	5982 EMD
CaCl₂ 2H₂O	Sigma Aldrich	442909
Folsäure	Sigma Aldrich	Nr. F7876
KOH	VWR	26668.263
100 x 20 mm Gewebekulturschale, mit Gewebekultur behandelt	Corning Incorporated	353003
Elektroporationsküvetten mit 2 mm Abstand, lange Elektrode	Geneflow GmbH	Nr. E6-0062
10 μl Impföse, blau 10 Micro L	ThermoScientific	129399
Spreizer, L-förmig, steril	Greiner Bio-One	730190