Visualisierung einzelliger bakterieller Interaktionen

Zusammenfassung

Quelle: Yarringto, K. D., et al. Kinetische Visualisierung von einzelligen bakteriellen Interaktionen zwischen den Spezies. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt die Vorbereitung eines Kokultursystems mit beweglichen und nicht-beweglichen Bakterien unter einem Agarose-Pad für die Bildgebung lebender Zellen. Es wird gezeigt, wie bewegliche Bakterien chemische Lockstoffe erkennen und in unbewegliche Kolonien eindringen, wodurch bakterielle Wechselwirkungen aufgedeckt werden.

Protokoll

1. Vorbereitung der Bakterienzellen und Impfpads

1. Messen Sie die optische Dichte (OD₆₀₀) jeder Subkultur und verdünnen Sie Pseudomonas aeruginosa auf OD₆₀₀ = 0,03 und Staphylococcus aureus auf OD₆₀₀ = 0,10 in M8T (Minimum Medium 8 + Trypton), das auf 37 °C vorgewärmt wird. P. aeruginosa und S. aureus im Verhältnis 1:1 mischen und vortexen.
   ANMERKUNG: Wenn Stämme Antibiotika benötigen, können sie der Übernacht- und Subkultur zugesetzt werden, aber sie sollten nicht hinzugefügt werden, wenn Arten für die Bildgebung gemischt werden, wenn sie die anderen Arten in der Kokultur betreffen. Die Stabilität des Plasmids und die Auswirkungen von Antibiotika auf alle Spezies in der Kokultur müssen für jeden verwendeten Organismus/jedes verwendete Plasmid bestimmt werden.
2. Pipettieren Sie 1 μl Kokultur gleichmäßig über den Boden einer vorgewärmten, sterilen 35-mm-Glasdeckglasschale.
3. Entferne den Silikonausschnitt mit einer sterilen Pinzette aus der Form.
4. Nehmen Sie das Pad mit sterilen Spateln aus der Schale.
   1. Schieben Sie den leicht gebogenen Spachtel unter den Rand des Pads, während Sie die Form auf den Kopf stellen, um sie auf einen sterilen Petriplattendeckel fallen zu lassen.
      ANMERKUNG: Brechen Sie das Pad nicht mit Gewalt heraus, da es sonst reißt. Behalten Sie im Auge, welche Seite des Polsters die Unterseite ist.
5. Übertragen Sie das Pad mit der Unterseite nach unten in die Schale mit den Bakterienzellen, indem Sie den um 90° abgewinkelten Spatel unter das Pad schieben und auf das geimpfte Deckglas legen. Mit dem um 90° abgewinkelten Spachtel das Pad bündig mit dem Deckglas abschließen und eventuelle Luftblasen vorsichtig ausdrücken.
6. Entfernen Sie überschüssige Feuchtigkeit von feuchten Tüchern und legen Sie sie um den Rand der Schüssel, wobei Sie darauf achten müssen, dass sie das Pad nicht berühren. Die Probe ist nun bereit für die Bildgebung.

Materialien