Anreicherung bakterieller Lipoproteine mittels nichtionischer Detergenzien-Phasentrennung

Zusammenfassung

Quelle: Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Anreicherung bakterieller Lipoproteine und Präparation von N-terminalen Lipopeptiden zur Strukturbestimmung durch Massenspektrometrie. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Anreicherung von bakteriellen Lipoproteinen mit einem nichtionischen Detergens, das beim Erwärmen eine Phasentrennung erfährt. Durch sequentielle Temperaturverschiebungen und Zentrifugationsschritte werden Lipoproteine selektiv in die Detergenzphase aufgeteilt, während Nicht-Lipoprotein-Verunreinigungen entfernt werden. Die angereicherten Lipoproteine werden dann gefällt, gewaschen und für nachgelagerte Anwendungen resuspendiert.

Protokoll

1. Anreicherung von Lipoproteinen durch Triton X-114 (TX-114) Phasenteilung

1. Ergänzen Sie das bakterielle Lysat mit TX-114-Tensid auf eine Endkonzentration von 2 % (vol/vol), indem Sie ein gleiches Volumen von 4 % (vol/vol) Tensid in eiskalter Tris-gepufferter Kochsalzlösung/Ethylendiamintetraessigsäure (TBSE) hinzufügen und 1 h lang auf Eis inkubieren, wobei Sie alle ~15 min durch Inversion mischen.
   ANMERKUNG: Beim Abkühlen sind der Überstand und das Tensid mischbar.
2. Das Röhrchen in ein 37 °C heißes Wasserbad stellen und 10 Minuten inkubieren, um eine Phasentrennung zu induzieren. Zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die zweiphasige Trennung aufrechtzuerhalten.
3. Die obere wässrige Phase vorsichtig abpipettieren und verwerfen. Geben Sie eiskaltes TBSE in die untere Tensidphase, um das Röhrchen wieder auf sein ursprüngliches Volumen zu füllen, und drehen Sie es zum Mischen um. 10 min auf Eis inkubieren.
4. Das Röhrchen wird in ein 37 °C warmes Wasserbad überführt und 10 Minuten lang inkubiert, um eine Phasentrennung zu induzieren, dann wird es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 10.000 x g zentrifugiert.
5. Wiederholen Sie die Schritte 1.3-1.4 noch einmal, um insgesamt 3 Trennungen zu erhalten. Entfernen Sie die obere wässrige Phase und entsorgen Sie sie.
6. Entfernen Sie Pellets von gefällten Proteinen, die sich im Laufe der Extraktionen gebildet haben (sichtbar am Boden des Röhrchens), indem Sie 1 Volumen eiskaltes TBSE zur Tensidphase hinzufügen. Zentrifugieren Sie bei 4 °C bei 16.000 x g für 2 Minuten, um unlösliches Protein zu pelletieren.
   ANMERKUNG: Die Probe sollte in einer einzigen Phase bleiben. Wenn eine Phasentrennung auftritt, die Probe erneut abkühlen und erneut zentrifugieren. Das Pellet besteht im Allgemeinen aus Nicht-Lipoprotein-Verunreinigungen, kann aber für die weitere Analyse zurückgehalten werden.
7. Den Überstand sofort in ein frisches 2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 1250 μl 100 % Aceton überführen. Pipettieren Sie gründlich auf und ab, um die Probe von der Spitze zu waschen, da sie zähflüssig ist. Durch Inversion mischen und über Nacht bei -20 °C inkubieren, um das Protein auszufällen.
8. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 20 min bei Raumtemperatur, um Lipoproteine unter Berücksichtigung der Ausrichtung des Röhrchens zu pelletieren. Lipoproteine bilden einen dünnen, weißen Film entlang der Außenwand des Röhrchens.
9. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 100% Aceton. Dekantieren Sie das Aceton und lassen Sie die Probe an der Luft trocknen.
10. Fügen Sie 20-40 μl 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 oder einen Standard-Laemmli SDS-PAGE-Probenpuffer hinzu und resuspendieren Sie gründlich, indem Sie mit den gefällten Lipoproteinen an der Wand auf und ab pipettieren. Kratzen Sie mit der Pipettenspitze an der Seite des Röhrchens herum, um Lipoproteine zu entfernen.
    ANMERKUNG: Lipoproteine lösen sich nicht in Tris-Puffer auf, sondern bilden eine Suspension.
    1. Lipoproteine bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.

Materialien