Aufreinigung von aus Bakterien gewonnenen rekombinanten P-Domänenproteinen des humanen Norovirus

Zusammenfassung

Quelle: Leuthold, M. M., et al. Herstellung von humanen Norovirus-hervorstehenden Domänen in E. coli für die Röntgenkristallographie. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video zeigt die Aufreinigung der rekombinanten humanen Norovirus-P-Domäne mittels Größenausschlusschromatographie und hebt die Trennung des Zielproteins von Verunreinigungen mit höherem und niedrigerem Molekulargewicht auf der Grundlage der unterschiedlichen Porenzugänglichkeit hervor. Der Prozess wird durch UV-Absorption überwacht und durch SDS-PAGE-Analyse der eluierten Fraktionen bestätigt.

Protokoll

1. 3. Reinigungsschritt

1. Waschen Sie die Pumpen und Rohrleitungen des HPLC-Aufreinigungssystems (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) und äquilibrieren Sie die SEC-Säule (Size Exclusion Chromatographie) (siehe Materialliste) mit GFB (Gel-Filtrationspuffer).
2. Die P-Domäne wird je nach Volumen der konzentrierten Probe mit einer Flussrate von 1 ml/min mit einem Superloop (bis zu 12 ml) oder einer Schleife (bis zu 3 ml) in die Säule injiziert. Erhöhen Sie nach Beendigung der Injektion die Durchflussrate auf 2,5 ml/min.
3. Wenn die OD (optische Dichte) zunimmt und sich die P-Domäne von der Säule löst, sammeln Sie Fraktionen von 1,5 ml. Kontrollieren Sie Fraktionen mit SDS-PAGE mit einem 12%igen Gel (Abbildung 1A und 1B). Mischen Sie nur die reinsten Fraktionen und konzentrieren Sie auf ~ 3 mg/ml und ~ 8 mg/ml.
   Hinweis: Nach ~110 ml (Void-Volumen) werden die meisten Verunreinigungen aus einer SEC-Säule mit 320 ml Bettvolumen eluiert. Die P-Domäne wird normalerweise als Dimer eluiert. Die Elutionszeit/das Elutionsvolumen des P-Domänendimers hängt vom Vorbereitungsgrad (pg) der SEC-Säule ab.

Ergebnisse

Abbildung 1. Schematische und repräsentative Ergebnisse für den 3. Reinigungsschritt.
Chromatogramm der P-Domain-Elution mittels SEC und entsprechendem SDS-PAGE-Ergebnis. Schwarze Zahlen geben die Fraktionen an, die gesammelt werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DNA der P-Domäne	Lebenstechnologien		GeneArt Gensynthese
Vivaspin 20	GE Gesundheitswesen	verschieden	Abschaltung von 10 kDa, 30 kDa und 50 kDa verwendet
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Gesundheitswesen	28-9893-34	SEC-Spalte