Selektive Aufreinigung eines bakteriellen Proteins durch negative Ionenaustauschchromatographie

Zusammenfassung

Quelle: Kuo, T., et al. Einstufige negative chromatographische Aufreinigung von Helicobacter pylori Neutrophilen-aktivierendem Protein, das in Escherichia coli im Batch-Modus überexprimiert wurde. J. Vis. Exp. (2016)

Das Video zeigt eine negative Chromatographie-Technik zur Aufreinigung eines Virulenz-assoziierten Proteins aus einem bakteriellen Lysat. Durch die Verwendung eines positiv geladenen Harzes in einer gepufferten Lösung werden Wirtszellproteine selektiv zurückgehalten, während das nahezu neutrale Zielprotein ungebunden bleibt und im Durchfluss gesammelt wird. Diese Methode ermöglicht eine effiziente Trennung und Rückgewinnung des Zielproteins für Downstream-Anwendungen.

Protokoll

1. Expression von rekombinantem HP-NAP in Escherichia coli (E. coli)

1. Bereiten Sie das Plasmid pET42a-NAP vor, das die DNA-Sequenz des neutrophilenaktivierenden Proteins Helicobacter pylori (HP-NAP) aus dem Stamm H. pylori 26695 enthält, wie zuvor beschrieben. Bereiten Sie die Plasmide vor, die die DNA-Sequenz von HP-NAP mit den gewünschten Punktmutationen enthalten.
2. 10 ng der oben genannten DNA-Plasmide werden durch Hitzeschock für 45 Sekunden bei 42 °C in E . coli BL21 (DE3)-fähige Zellen transformiert, die Zellen auf Lysogenie-Bouillon (LB)-Agarplatten mit 50 μg/ml Kanamycin gestreift und die Platten 16 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.
3. Einzelne Kolonien in einzelnen Röhrchen mit 5 ml LB-Bouillon mit 50 μg/ml Kanamycin inokulieren und als Vorkulturen bei 37 °C für 16 h und Schütteln bei 170 U/min züchten.
4. 2 ml der oben genannten Vorkulturzellen werden in 200 ml LB-Bouillon mit 50 μg/ml Kanamycin in einem 1-l-Kolben inokuliert. Der inokulierte Kulturkolben wird 2 Stunden lang bei 37 °C unter Schütteln bei 170 U/min inkubiert, bis die Extinktion bei 600 nm etwa 0,4 bis 0,5 nm erreicht, die mit einem UV/VIS-Spektralphotometer (UV/VIS) detektiert wird.
5. 80 μl 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) werden in die obige Kultur bis zu einer Endkonzentration von 0,4 mM gegeben, um die Expression von HP-NAP zu induzieren. Inkubieren Sie die Kultur 3 Stunden lang, bis die Extinktion bei 600 nm etwa 1,6-1,7 erreicht.
6. Die Zellen werden bei 6.000 x g bei 4 °C 15 min lang zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Lagern Sie das Zellpellet bis zur Reinigung bei -70 °C.

2. Herstellung der löslichen Proteinfraktion, die HP-NAP enthält

ANMERKUNG: Alle folgenden Schritte werden bei 4 °C durchgeführt.

1. 50 ml des im Protokollschritt 1.6 hergestellten Zellpellets werden in 20 ml 20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 50 mM NaCl mit 0,13 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,03 mM N-alpha-Tosyl-L-lysinyl-chlormethylketon (TLCK) und 0,03 mM N-Tosyl-L-phenylalaninyl-chlormethylketon (TPCK) bei 4 °C resuspendiert, wie zuvor beschrieben.
2. Zerstören Sie die Bakterienzellen, indem Sie die Bakteriensuspension 7-mal bei 4 °C durch einen Hochdruck-Homogenisator leiten, der in einem Bereich von 15.000 bis 20.000 psi betrieben wird.
3. Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 30.000 × g bei 4 °C für 1 Stunde, um die löslichen und unlöslichen Proteinfraktionen mit einer Ultrazentrifuge zu trennen. Der Überstand als lösliche Proteinfraktion wird in ein Becherglas überführt.
4. Messen Sie die Proteinkonzentration der löslichen Proteinfraktion nach der Bradford-Methode unter Verwendung eines handelsüblichen Kits mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard gemäß den Anweisungen des Herstellers.
5. 177,6 μl 1 N HCl in 20 ml der löslichen Proteinfraktion aus Protokollschritt 2.3 geben, um den pH-Wert von pH 9,0 auf pH 8,0 einzustellen.
6. Geben Sie 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl zu der obigen Proteinlösung, um die endgültige Proteinkonzentration auf 0,5 mg/ml zu erreichen.

3. Aufreinigung von rekombinantem HP-NAP aus E. coli durch Negativmoden-Batch-Chromatographie mit DEAE-Ionenaustauscherharzen

1. Bereiten Sie 15 ml Diethylaminoethyl (DEAE)-Harze vor.
   1. Wiegen Sie 0,6 g trockenes Pulver DEAE-Harze ab und suspendieren Sie es in 30 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl bei Raumtemperatur für mindestens 1 Tag.
   2. Zentrifugieren Sie das Harz bei 10.000 x g bei 4 °C für 1 min.
   3. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
   4. Fügen Sie 15 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl hinzu.
   5. Wiederholen Sie die Protokollschritte 3.1.2 bis 3.1.4 noch viermal.
   6. Lagern Sie das 15 ml abgesetzte Harz (50 % Slurry in 30 ml Tris-Puffer) bei 4 °C für die spätere Verwendung.
      ANMERKUNG: Alle folgenden Schritte werden bei 4 °C durchgeführt.
2. 45 ml der im Protokollschritt 2,6 hergestellten löslichen Proteine werden auf 15 ml des Harzes zugegeben und die Protein-/Harzaufschlämmung mit einem Magnetrührer bei 4 °C 1 Stunde lang gerührt.
3. Gießen Sie die Protein-/Harzaufschlämmung in eine Kunststoff- oder Glassäule, die mit einem Absperrhahn ausgestattet ist. Lassen Sie das Harz unter der Schwerkraft absetzen.
4. Öffnen Sie den Absperrhahn, damit die Proteinlösung durch die Schwerkraft durch die Säule laufen kann, bis der Flüssigkeitsspiegel in der Säule knapp über dem Harz liegt. Sammeln Sie den Durchfluss als ungebundene Fraktion, die das gereinigte HP-NAP enthält.
5. 15 ml eiskaltes 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl in die Säule geben.
6. Öffnen Sie den Absperrhahn, damit der Waschpuffer durch die Schwerkraft durch die Säule laufen kann, bis der Flüssigkeitsstand in der Säule knapp über dem Harz liegt. Sammeln Sie den Durchfluss als Waschfraktion.
7. Wiederholen Sie die Protokollschritte 3.5 bis 3.6 noch viermal, um die zusätzlichen Waschfraktionen zu sammeln.

Materialien