Ein Verfahren zur Aufreinigung eines Polyhistidin-markierten Proteins aus Streptococcus mutans

Zusammenfassung

Quelle: Murata, T., et al. Aufreinigung eines Proteins mit hoher molekularer Masse in Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt ein Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Aufreinigung eines Polyhistidin-markierten Proteins, das von Streptococcus mutans sezerniert wird.

Protokoll

1. Proteine aus dem Kulturüberstand werden durch Ammoniumsulfatfällung konzentriert.
   ANMERKUNG: Extrakt aus Zellkörpern, wenn ein Zielprotein intrazellulär ist.
   1. Die Suspension der Bakterienkultur (Streptococcus mutans) wird 20 Minuten lang bei 10.000 x g bei 4 °C zentrifugiert. Der Kulturüberstand wird in ein 3-Liter-Becherglas überführt.
   2. 1.122 g Ammoniumsulfat zu 2 L des Überstands (80 % Sättigung) unter kräftigem Rühren mit einem Magnetrührer geben. Den Niederschlag mindestens 4 h bei 4 °C unter Rühren ziehen lassen.
      ANMERKUNG: Die Niederschlagsbildung kann über Nacht fortgesetzt werden.
   3. Die mit Ammoniumsulfat gefällte Lösung bei 15.000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand dekantieren.
   4. Den Niederschlag mit einem Spatel auffangen und in ein 200-ml-Glasbecherglas geben. Resuspendieren Sie die Pellets in 35 mL Bindungspuffer (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 5 mM Imidazol, pH 8,0).
   5. Die Suspension wird mit einem regenerierten Cellulose-Dialyseschlauch bei 4 °C unter Rühren gegen 2.500 ml des Bindungspuffers dialysiert. Wechseln Sie die Dialyselösung nach 2 h und setzen Sie die Dialyse über Nacht fort.
   6. Tauschen Sie die Dialyselösung wieder aus. Dialysieren Sie weitere 2 Stunden lang.
2. Die dialysierte Suspension wird bei 20.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird durch einen Membranfilter mit Hilfe einer Saugfilteranlage filtriert. Das Filtrat in einen 75 cm² Kolben überführen.
3. Fraktionieren Sie die Polyhistidin-markierte Glucosyltransferase-SI (GTF-SI) aus der filtrierten Suspension durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC).
   1. Übertragen Sie 2 mL der Ni-geladenen IMAC-Harzaufschlämmung (ca. 1 mL Harz) in eine chromatographische Säule, deren Auslass an einem Silikonschlauch angebracht ist. Entnahme der Aufbewahrungslösung durch die Schwerkraftströmung.
      VORSICHT: Lassen Sie das Harz im gesamten IMAC nicht austrocknen.
   2. Geben Sie 3 ml destilliertes Wasser in die Säule, um das Harz zu waschen. Fügen Sie 5 ml des Bindungspuffers hinzu, um das Harz auszugleichen.
   3. Schalten Sie den Durchfluss mit einem Hoffmann-Quetschhahn ab. Fügen Sie 5 ml der gefilterten Suspension aus Schritt 2 hinzu, um die Aufschlämmung herzustellen.
   4. Geben Sie die gesamte Gülle in die verbleibende gefilterte Suspension. Die Mischung 30 min bei 4 °C leicht schwenken.
   5. Laden Sie das Gemisch zurück auf die Säule. Entfernen Sie die Suspension durch die Schwerkraft. Waschen Sie das IMAC-Harz mit 20 ml Bindepuffer.
      ANMERKUNG: Stellen Sie die Durchflussrate mit einem Hoffmann-Quetschhahn während des gesamten nachfolgenden IMAC auf ca. 2 mL/min ein.
   6. Eluieren Sie das rekombinante GTF-SI mit 20 mL des Elutionspuffers (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazol, pH 8,0).
      ANMERKUNG: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Das Eluat sollte bei 4 °C gelagert werden. IMAC-Harz kann wiederverwendet werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zentrifugal-Ultrafiltrationsanlage	Schneidermuskel	Nr. VS2032	Pufferersatz und Proteinkonzentration
Zentrifuge	Kubota	7780II
Chromatographische Säule	Bio-Rad	7321010	Für IMAC
Membranklemme für Dialyse	Marke Fisher	21-153-100
Schläuche für Dialyse	Als Einheit	2-316-06
Imidazol	Wako	095-00015	Vorbereitung des Bindungspuffers und des Elutionspuffers
Brutkasten	Nippon Medical & Chemical Instruments	LH-100-RDS	Temperatureinstellung: 37 °C
Mikrozentrifuge	Kubota	3740
Natriumchlorid	Wako	191-01665	Vorbereitung von Bindungspuffer und Elutionspuffer
Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat	Wako	192-02815	Vorbereitung von Bindungspuffer und Elutionspuffer
Natriumhydroxid	Wako	198-13765	Vorbereitung von Bindungspuffer und Elutionspuffer
Ammoniumsulfat	Wako	015-06737	Ammoniumsulfat-Fällung
Ni-geladenes Harz	Bio-Rad	1560133	Für IMAC
Membranfilter	Merck Millipore	JGWP04700	0,2 μm Durchmesser