Messung der Wirkstoffbindung an Caseum aus Tuberkulose-Läsionen mit der Rapid Equilibrium-Dialysemethode

Zusammenfassung

Quelle: Sarathy, J. P. et al. Ein In-vitro-Caseum-Bindungsassay, der die Penetration von Medikamenten in Tuberkuloseläsionen vorhersagt. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt einen In-vitro-Assay zur Messung der Wirkstoffbindung an das Caseum von Tuberkuloseläsionen mittels Schnellgleichgewichtsdialyse. Es beschreibt die Schritte zur Herstellung von Caseumsuspensionen, zur Durchführung der Dialyse und zur Berechnung der ungebundenen Wirkstofffraktion, um das Eindringen des Medikaments in das Caseum vorherzusagen.

Protokoll

1. Rapid Equilibration Dialysis (RED) Assay

1. 6,5 μl der 500 μM Lösung der Testverbindung in 643,5 μl des Homogenats spießen, um die Endkonzentration von 5 μM (≤1 % DMSO) zu erreichen und zu wirbeln.
2. Setzen Sie die ROTEN Einsätze in die Grundplatte ein. Geben Sie 200 μl der mit Wirkstoffen dotierten Matrix in die Spenderkammer (roter Ring) jedes RED-Einsatzes und 350 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in jede Empfängerkammer. Bereiten Sie 3 Einsätze für jede Testverbindung vor (dreifache Proben). Dichtplatte mit einer Klebeplatte versiegeln und bei 37 °C auf dem Thermomischer bei 200 U/min (1 x g) für 4 h inkubieren.
3. Mischen Sie nach der Inkubation den Inhalt der Spender- und Empfängerkammer vorsichtig, indem Sie 2-3 Mal auf und ab pipettieren. Pipettieren Sie 20 μl Aliquots des Homogenats aus den Donorkammern und fügen Sie es zu 20 μl sauberem PBS in einem 1,5-ml-Röhrchen hinzu (1:1). Pipettieren Sie auf ähnliche Weise 20 μl Aliquots von PBS-Proben aus den Empfängerkammern und fügen Sie sie zu 20 μl sauberem Homogenat hinzu (Matrixabgleich).
   ANMERKUNG: Durch den Matrixabgleich müssen keine 2 separaten Kalibrierkurven (in Homogenat und PBS) für die quantitative Analyse erstellt werden. Der Inhalt der Spenderkammer kann sich im Laufe der Zeit sedimentieren. Mischen Sie den Inhalt vorsichtig durch Pipettieren, bevor Sie Aliquots entfernen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Pierce RED Gerät Wiederverwendbare Grundplatte	Fisher Scientific	PI-89811
Pierce RED Geräteeinsätze, 50/Karton	Fisher Scientific	PI-89809
Pierce RED Werkzeug zum Entfernen von Einsatzeinsätzen	Fisher Scientific	89812
Klebeplatten-Dichtung	Fisher Scientific	08-408-240
PBS, pH 7,4, 10x 500 mL (Gibco)	Lebenstechnologien	10010-049
DMSO	Sigma	472301