Mikrofluidische Zeitraffermikroskopie zur Untersuchung der Antibiotika-Persistenz in Bakterien

Abstract

Quelle: Oms, T., et al. Populations- und Einzelzellanalyse der Antibiotikapersistenz in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2023)

Dieses Video stellt ein Protokoll zur Überwachung einzelner Bakterienzellen vor, die ein fluoreszenzmarkiertes DNA-bindendes Protein in einem mikrofluidischen System exprimieren. Es zeigt, wie Antibiotika die meisten Zellen hemmen, während eine Subpopulation von Persisterzellen die Behandlung überlebt und nach der Entfernung von Antibiotika wieder nachwächst.

Protocol

Mikrofluidische Zeitraffer-Mikroskopie

ANMERKUNG: Der folgende Abschnitt beschreibt die Vorbereitung der mikrofluidischen Platte sowie das Verfahren der Zeitraffer-Bilderfassung und Bildanalyse. Ziel dieses Experiments ist es, den Persistenzphänotyp nach Antibiotikabehandlung auf Einzelzellebene zu beobachten und zu analysieren. Die während dieses Experiments gesammelten Daten können verwendet werden, um eine breite Palette von Ergebnissen zu generieren, abhängig von der Fragestellung und/oder den während des Experiments verwendeten Fluoreszenzreportern. In dem hier beschriebenen Experiment wurde eine quantitative Analyse der Zelllänge und der HU-mCherry-Fluoreszenz durchgeführt, die die Nukleoidorganisation in Persister- und Nicht-Persisterzellen widerspiegelt.

1. Bakterielle Zellkultur für die mikrofluidische Zeitraffermikroskopie
   1. Beimpfen Sie 5 ml Medium (3-[N-Morpholino]propansulfonsäure (MOPS)-Glycerin 0,4 %, bei Bedarf mit einem selektiven Antibiotikum) mit einer isolierten Kolonie in einem Glasröhrchen (≥25 ml) und stellen Sie das Röhrchen über Nacht (zwischen 15 h und 19 h) in einen Schüttelinkubator, der auf 37 °C und 180 U/min eingestellt ist.
   2. Messen Sie am nächsten Tag den OD₆₀₀ nm und verdünnen Sie die Kultur in frischem temperaturangepasstem Medium (37 °C, MOPS-Glycerin 0,4 %) in einem Glasröhrchen auf einen endgültigen OD₆₀₀ nm von ~0,001. Lassen Sie die Kultur über Nacht (zwischen 15 h und 19 h) in einem Schüttelinkubator bei 37 °C und 180 U/min wachsen, um am nächsten Tag eine Kultur in der frühen exponentiellen Phase zu erhalten.
2. Vorbereitung der mikrofluidischen Platte und Zeitraffer-Mikroskopie
   ANMERKUNG: Mikrofluidische Experimente können in kommerziell erhältlichen mikrofluidischen Geräten (wie hier beschrieben) oder in selbst hergestellten mikrofluidischen Systemen durchgeführt werden.
   1. Entfernen Sie die Konservierungslösung (falls vorhanden) aus allen Vertiefungen der mikrofluidischen Platte und ersetzen Sie sie durch ein frisches Nährmedium.
      ANMERKUNG: Wenn die mikrofluidische Platte eine Abfallauslassvertiefung enthält, sollte die Konservierungslösung der Auslassvertiefung entfernt, aber nicht durch das Medium ersetzt werden.
   2. Versiegeln Sie die mikrofluidische Platte mit dem Verteilersystem, indem Sie auf die Schaltfläche Versiegeln klicken oder über die mikrofluidische Software (wählen Sie zuerst Werkzeug, dann Siegelplatte).
      ANMERKUNG: Um die Platte abzudichten, sollte ein gleichmäßiger Druck auf die Platte und den Verteiler ausgeübt werden, indem die Platte manuell gegen den Verteiler gedrückt wird. Bei korrekter Ausführung sollte der Hinweis "versiegelt" auf der ONIX2-Schnittstelle erscheinen. Es ist wichtig, keinen Druck auf den Glasschieber auszuüben, um ein mögliches Risiko eines Bruchs des Verteilers zu vermeiden.
   3. Führen Sie nach dem Versiegeln eine erste Ansaugsequenz durch (klicken Sie auf Run Liquid Priming Sequence auf der Oberfläche der mikrofluidischen Software).
      HINWEIS: Die Flüssig-Priming-Sequenz entspricht einer Perfusionssequenz von 5 Minuten bei 6,9 kPa für die Vertiefungen 1 bis 5, gefolgt von einer 5-minütigen Perfusion bei 6,9 kPa für Bohrung 8 und einer abschließenden Perfusionsrunde für Bohrung 6 für 5 Minuten bei 6,9 kPa. Die Run Liquid Priming Sequence ermöglicht die Entfernung der Konservierungslösung, die möglicherweise noch in den Kanälen vorhanden ist, die die verschiedenen Vertiefungen verbinden.
   4. Inkubieren Sie die Platte in einem thermostatisch geregelten Schrank des Mikroskops bei der gewünschten Temperatur (hier 37 °C) für mindestens 2 h vor Beginn der Mikroskopie-Bildgebung.
   5. Starten Sie eine zweite Run Liquid Priming Sequence , bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
   6. Versiegeln Sie die mikrofluidische Platte, indem Sie auf der mikrofluidischen Softwareoberfläche auf Versiegeln klicken. Ersetzen Sie das Medium in Vertiefung 1 und Vertiefung 2 durch 200 μl Frischmedium, in Vertiefung 3 durch 200 μl Frischmedium, das das Antibiotikum enthält (hier Ofloxacin (OFX) in 5 μg·^mL-1), in Vertiefung 4 und Vertiefung 5 durch 200 μl Frischmedium, in Vertiefung 6 durch 200 μl Frischmedium, und in Vertiefung 8 mit 200 μl der Kulturprobe (aus Schritt 1.2), verdünnt auf einen OD₆₀₀ nm von 0,01 im frischen Medium.
   7. Verschließen Sie die mikrofluidische Platte wie in Schritt 2.2 beschrieben und setzen Sie sie auf das Mikroskopobjektiv im Mikroskopschrank.
      ANMERKUNG: Stellen Sie sicher, dass Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Mikroskopobjektiv geben, bevor Sie die Mikrofluidikplatte platzieren.
   8. Klicken Sie in der Mikrofluidik-Software auf Zellbeladung , um die Zellbeladung in die Mikrofluidikplatte zu ermöglichen.
      ANMERKUNG: Der Zellladeschritt umfasst 15 s Perfusion bei 13,8 kPa für Bohrung 8, gefolgt von 15 s Perfusion bei 27,6 kPa für Bohrung 6 und Bohrung 8 und eine abschließende Perfusionsrunde für Bohrung 6 für 30 s bei 6,9 kPa. Die Dichte der Zellen in der mikrofluidischen Platte ist entscheidend für das Experiment. Der erste Teil dieses mikrofluidischen Protokolls besteht darin, Bakterien vor der Antibiotikabehandlung 6 Stunden lang in einem frischen Medium zu züchten. Nach 6 Stunden Wachstum muss die Zelldichte ausreichend sein, um die seltenen Persisterzellen zu detektieren (unter den in dieser Studie verwendeten Bedingungen erzeugen sich die Persisterzellen mit einer Frequenz von ^10-4). Ist die Zelldichte zu hoch, ist es schwierig, die einzelnen Zellen zu unterscheiden, was eine präzise Einzelzellanalyse verhindert. Da die Wachstumsrate direkt vom Medium abhängt, sollte die Dichte der Zellen in den Mikroskopiefeldern vor dem Start des Experiments bestimmt werden.
   9. Stellen Sie im Durchlichtmodus einen optimalen Fokus ein und wählen Sie mehrere interessante Regionen (ROIs) aus, in denen eine geeignete Zellenanzahl beobachtet wird (bis zu 300 Zellen pro Feld).
      ANMERKUNG: Wählen Sie mindestens 40 ROIs aus, um sicherzustellen, dass die seltenen Persisterzellen abgebildet werden.
   10. Klicken Sie in der Mikrofluidik-Software auf Protokoll erstellen. Die Injektion des Frischmediums bei 6,9 kPa für 6 h (Vertiefung 1-2), gefolgt von der Injektion des Mediums, das das Antibiotikum enthält, bei 6,9 kPa für 6 Stunden (Vertiefung 3) und schließlich die Injektion des Frischmediums bei 6,9 kPa für 20 Stunden (Vertiefung 4-5).
       ANMERKUNG: Eine auf einen OD₆₀₀ nm von 0,01 verdünnte Bakterienkultur ermöglicht es den Bakterien, 6 Stunden lang in der mikrofluidischen Kammer zu wachsen, wodurch sichergestellt wird, dass sich die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase befinden. Abhängig von der Anzahl der Zellen, die während des Ladeschritts in das mikrofluidische Gerät eingeführt werden (siehe Schritt 2.8), kann die Dauer der Wachstumsphase angepasst werden, um bis zu 300 Zellen pro ROI zu erhalten. Da Persistenz ein seltenes Phänomen ist, verbessert eine Erhöhung der Anzahl der Zellen pro ROI die Möglichkeit, Persisterzellen zu beobachten. Die Zellzahl sollte jedoch 300 Zellen pro ROI nicht überschreiten, da dies die Einzelzellanalyse mühsam macht.
   11. Führen Sie die Mikroskopie-Bildgebung im Zeitraffermodus mit einem Bild alle 15 Minuten unter Verwendung des Durchlichts und der Anregungslichtquelle für den Fluoreszenzreporter durch. Hier wurde eine 560 nm Anregungslichtquelle für das mCherry Signal verwendet (580 nm LED bei 10% Leistung mit Filter 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] und 100 ms Belichtung für mCherry). Für die Zellbildgebung wurde die Zeiss-kompatible Software Zen3.2 verwendet.
3. Bildanalyse
   ANMERKUNG: Das Öffnen und Visualisieren der Mikroskopiebilder erfolgt mit der Open-Source-Software ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/). Die quantitative Bildanalyse wird mit der Open-Source-Software ImageJ/Fiji und dem kostenlosen MicrobeJ-Plugin (https://microbej.com) durchgeführt. In diesem Protokoll wurde die Version MicrobeJ 5.13I(14) verwendet.
   1. Öffnen Sie die ImageJ/Fiji-Software auf dem Computer und ziehen Sie die Hyperstack-Zeitraffer-Mikroskopiebilder in die Fiji-Ladeleiste. Verwenden Sie Image > Color > Make Composite, um die verschiedenen Kanäle des Hyperstacks zu verschmelzen. Wenn die Kanäle des Zeitraffer-Experiments nicht der gewünschten Farbe entsprechen (z. B. wird der Phasenkontrast in Rot statt in Grau angezeigt), verwenden Sie Bild > Farbe > Kanäle anordnen , um die entsprechende Farbe auf die Kanäle anzuwenden.
   2. Öffnen Sie das MicrobeJ-Plugin und erkennen Sie die Bakterienzellen über die manuelle Bearbeitungsoberfläche. Löschen Sie die automatisch erkannten Zellen und skizzieren Sie die relevanten Persisterzellen manuell Frame für Frame.
      ANMERKUNG: Über verschiedene Einstellungen können einzelne Zellen automatisch erkannt werden. Hier kam die manuelle Detektion zum Einsatz, da die analysierten Persisterzellen lange Filamente bilden, die mit der automatischen Detektion selten korrekt detektiert werden.
   3. Verwenden Sie nach der Erkennung das Symbol "Ergebnis " in der manuellen Bearbeitungsoberfläche von MicrobeJ, um eine ResultJ-Tabelle zu generieren. Speichern Sie die ResultJ-Datei, und verwenden Sie sie, um Einblicke in verschiedene Parameter zu erhalten, die in der Einzelzellanalyse von Interesse sind. In diesem Protokoll wurden die mittlere Fluoreszenz der HU-mCherry-Intensität, die Zelllänge und die Zellfläche der einzelnen Zellen exportiert.

Materials