Screening von zyklischen di-GMP-Modulatoren unter Verwendung von Bakterien, die ein fluoreszierendes Reporterprotein exprimieren

Abstract

Quelle: Rugjee, K. N., et al. Etablierung eines Hochdurchsatzaufbaus für das Screening kleiner Moleküle, die die c-di-GMP-Signalübertragung in Pseudomonas aeruginosa modulieren. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video zeigt das Screening von zyklischen di-GMP-Modulatoren unter Verwendung genetisch veränderter Bakterien, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter der Kontrolle eines c-di-GMP-sensitiven Promotors exprimieren. Die Fluoreszenz wird in einer Multiwell-Platte gemessen, die verschiedene Testverbindungen enthält. Verbindungen, die die c-di-GMP-Produktion hemmen, führen zu einer verminderten Fluoreszenz. Die Daten werden dann analysiert, um potenzielle Modulatoren des c-di-GMP-Signalwegs in Bakterien zu identifizieren.

Protocol

1. Erzeugung eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP), getaggt mit zyklischem di-GMP (c-di-GMP) Reporter, Pseudomonas aeruginosa, Stamm

1. 5 ml Medium mit Lysogenie-Bouillon (LB) mit einer einzigen Kolonie von P. aeruginosa beimpfen und über Nacht bei 37 °C und Schütteln bei 200 U/min inkubieren.
2. 2 ml der Übernachtkultur werden in 200 ml frisches LB-Medium in einem 1-l-Kolben überführt und bei 37 °C und Schütteln bei 200 U/min inkubiert.
3. Die optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) wird alle 30 min überwacht, indem eine 1-ml-Probe aus dem Kolben entnommen und mit einem Spektralphotometer untersucht wird.
4. Wenn der OD₆₀₀ einen Wert zwischen 0,3 und 0,5 erreicht, geben Sie 40 ml der Kultur in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
5. Pelletieren Sie die Zellen, indem Sie 10 Minuten lang bei 4 °C bei 8.000 U/min zentrifugieren, den Überstand verwerfen und die Zellen in 40 ml eiskalter, steriler 300 mM Saccharoselösung resuspendieren.
6. Die Zellen werden ein zweites Mal durch Zentrifugieren wie in Schritt 1.5 beschrieben pelletiert und in 20 ml eiskalter, steriler Saccharoselösung mit 300 mM resuspendiert.
7. Die Zellen werden ein letztes Mal durch Zentrifugieren wie in Schritt 1.5 beschrieben pelletiert und in 400 μl eiskalter, steriler Saccharoselösung mit 300 mM resuspendiert.
   Hinweis: Die Zelldichte sollte zu diesem Zeitpunkt etwa 1 x 10¹¹ koloniebildende Einheiten pro Milliliter (KBE/ml) betragen.
8. Kühle die Zellen 30 Minuten lang auf Eis, danach sind sie bereit für die Elektroporation.
9. 1 μl einer 0,2 μg/μl pCdrA::gfp C-Plasmidlösung werden zu 40 μl elektrokompetenten P. aeruginosa-Zellen gegeben, die oben in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen hergestellt wurden, das auf Eis vorgekühlt wurde. Mischen Sie die Suspension und geben Sie sie in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette mit einem Elektrodenspalt von 2 mm.
10. Entfernen Sie die Feuchtigkeit von der Außenseite der Küvette mit Seidenpapier und legen Sie die Küvette in die Probenkammer des Elektroporators. Impuls mit einer Spannung von 2,5 kV, einer Kapazität von 25 μF und einem Widerstand von 200 Ω.
11. Entfernen Sie die Küvette und fügen Sie 1 ml LB-Medium hinzu. Dann werden die Zellen in ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und 2 Stunden lang bei 37 °C und Schütteln bei 200 U/min inkubiert.
12. 10 μl, 50 μl und 100 μl Aliquots der Kultur werden auf sterile LB-Agar-Platten verteilt, die mit Ampicillin (in einer Konzentration von 100 μg/ml) ergänzt werden, und die Platten werden über Nacht bei 37 °C inkubiert.
13. Bestätigen Sie die GFP-Expression (Anregung bei 485 nm, Emission bei 520 nm), indem Sie die Platte unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Standard-GFP-Kanal untersuchen, und wählen Sie eine einzelne Kolonie aus, um 5 mL LB zu inokulieren. Inkubieren Sie über Nacht wie in Schritt 1.1 beschrieben. 0,5 ml der Nachtkultur mit 0,5 ml 50 % Glycerin in einem 2 ml Schraubröhrchen mischen und bei -80 °C lagern.

2. Vorbereitung der Starterkultur für die Inokulation

1. Zwei Tage vor dem Screening wird der P. aeruginosa-Stamm (mit dem Plasmid pCdrA::gfp^C ) aus dem -80 °C-Stamm auf eine LB-Agar-Platte (ergänzt mit Ampicillin in einer Konzentration von 100 μg/ml) plattiert, indem die Bakterien mit einer sterilen Impfschlaufe vorsichtig auf der Platte verteilt werden. Die Platte über Nacht bei 37 °C inkubieren.
2. Am Abend vor dem Screening wird eine einzelne Kolonie von P. aeruginosa aus der Platte in 10 ml LB-Medium (ergänzt mit Ampicillin in einer Konzentration von 100 μg/ml) in ein Röhrchen inokuliert und die Vorkultur über Nacht bei 37 °C und Schütteln bei 200 U/min inkubiert.
3. Bereiten Sie am Tag des Screenings eine Subkultur aus der Nacht-Vorkultur vor, indem Sie diese zuerst mit frischem LB-Medium auf einen OD₆₀₀ von 1,0 verdünnen und dann weiter mit 5 % LB auf einen OD₆₀₀ von 0,04 (Verhältnis 1:25) verdünnen.
   Hinweis: Das Gesamtvolumen des beimpften Mediums hängt von der Anzahl der zu prüfenden Platten ab. 5 % LB werden hergestellt, indem 100 % LB mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf die erforderliche Konzentration verdünnt werden. Wichtig ist, dass das Medium (5% LB) die konstitutive Aktivierung von pCdrA::gfp^C in P. aeruginosa ermöglicht.
4. Geben Sie einen sterilen Magnetrührstab in den Behälter und rühren Sie die Kultur bei minimaler Geschwindigkeit auf einem Magnetrührer 30 Minuten lang bei Raumtemperatur um, damit sich die Bakterien an das Medium gewöhnen können, bevor sie in 384-Well-Platten abgegeben werden.

3. Inokulation und Inkubation der 384-Well-Platten mit kleinen Molekülen

Hinweis: Sterilität und gute aseptische Techniken sind bei den folgenden Schritten von größter Bedeutung.

1. Zur Vorbereitung der Positivkontrolle (100%ige Hemmung) werden 20 μl Tobramycinsulfat (25 mg/ml) zu 10 ml (ausreichend für bis zu 12 Platten) der in Schritt 2.3 hergestellten Subkultur gegeben und vorsichtig gemischt. Pipettieren Sie 40 μl der Positivkontrollkultur in die Vertiefungen A23-P23 (Abbildung 1).
2. Zur Vorbereitung der Negativkontrolle (0 % Hemmung) 30 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) auf 10 ml (ausreichend für bis zu 12 Platten) der in Schritt 2.3 vorbereiteten Subkultur zugeben und vorsichtig mischen. Pipettieren Sie 40 μl der negativen Kontrollkultur in die Vertiefungen A24-P24 (Abbildung 1).
3. Für jede der mit den kleinen Molekülen geprägten Platten wird ein Volumen von 40 μl der verdünnten Übernachtkulturen (beschrieben in Schritt 2.3) in die Vertiefungen A1-P22 inokuliert (Abbildung 1).
   Hinweis: Dies kann mit einem Liquid-Handler-Roboter erreicht werden. Aufgrund der heterogenen Eigenschaften von Bakterienkulturen ist es wichtig, ein kontinuierliches und moderates Rühren aufrechtzuerhalten, um die Bakterien während der Abgabe gleichmäßig im Medium zu verteilen. Rühren Sie dazu die akklimatisierte Kultur aus Schritt 2.4 während der Abgabe immer wieder magnetisch um.
4. Die Platten mit einem luftdurchlässigen Deckel verschließen und 6 Stunden bei 37 °C inkubieren.
   Hinweis: Die luftdurchlässige Dichtung ist entscheidend, um die gleichbleibenden Bedingungen in allen 384 Vertiefungen aufrechtzuerhalten und die mögliche Entwicklung von Sauerstoffgradienten auf der Platte zu umgehen.

4. Messung des Wachstums (OD600) und des intrazellulären c-di-GMP-Spiegels (GFP)

1. Etwa 30 Minuten vor der spektrophotometrischen Messung den Plattenleser auf 37 °C vorwärmen, um Kondensation zu vermeiden.
2. Entfernen Sie vorsichtig die luftdurchlässige Deckeldichtung, bevor Sie lesen. Messen Sie die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm mit einer Einstellung von 10 Blitzen pro Vertiefung und einer Einschwingzeit von 0,2 Sekunden.
3. Nehmen Sie vor der Messung der Fluoreszenz eine automatische Verstärkungs- und Fokusanpassung auf der Grundlage von Vertiefung A24 (Negativkontrolle) vor und stellen Sie den Verstärkungszielwert auf 75 % ein (Abbildung 1).
   1. Klicken Sie in der Steuerungssoftware des Plattenlesers auf Messung starten und klicken Sie auf die Registerkarte "Fokus- und Verstärkungseinstellung/Platten-IDs".
   2. Wählen Sie ''Fokuseinstellung'' und ''Kanal A'' auf der rechten Seite des Fensters.
   3. Wählen Sie ''Gain Adjustment'' und ''Selected Well'' und geben Sie ''75'' als ''Zielwert'' ein. Zum Schluss wählen Sie im Plattenlayout gut A24 aus, bevor Sie auf ''Anpassung starten'' klicken. Sobald die Einstellung durchgeführt ist, klicken Sie auf "Messung starten".
   4. Messen Sie die Fluoreszenz des GFP-Reporters bei einem Anregungs-/Emissionsmaximum von 485/520 nm mit einer Einstellung von 10 Blitzen pro Vertiefung und einer Einschwingzeit von 0,2 Sekunden.
4. Sammeln Sie Daten von allen untersuchten Platten.
   Hinweis: Die Messwerte werden von der Steuerungssoftware des Plattenlesers automatisch als Standard gespeichert.
   1. Zeigen Sie die Messwerte an, indem Sie in der Steuerungssoftware auf das "Mars"-Symbol klicken, um das statistische Analysepaket zu öffnen.
   2. Rufen Sie die Daten ab, indem Sie auf die gewünschte Plattennummer doppelklicken, um auf die Daten für die Analyse zuzugreifen.

Results

Abbildung 1. Eine 384-Well-Plattenkarte, die für den Small Molecule Screening Assay verwendet wird. Die Verbindungen aus der Bibliothek (hellblau) werden in die Vertiefungen A1-P22 aliquotiert. Die "Positivkontrolle" (rot), bestehend aus eine...

Materials