Screening von zyklischen di-GMP-Modulatoren unter Verwendung von Bakterien, die ein fluoreszierendes Reporterprotein exprimieren

Abstract

Quelle: Rugjee, K. N., et al. Etablierung eines Hochdurchsatzaufbaus für das Screening kleiner Moleküle, die die c-di-GMP-Signalübertragung in Pseudomonas aeruginosa modulieren. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video zeigt das Screening von zyklischen di-GMP-Modulatoren unter Verwendung genetisch veränderter Bakterien, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter der Kontrolle eines c-di-GMP-sensitiven Promotors exprimieren. Die Fluoreszenz wird in einer Multiwell-Platte gemessen, die verschiedene Testverbindungen enthält. Verbindungen, die die c-di-GMP-Produktion hemmen, führen zu einer verminderten Fluoreszenz. Die Daten werden dann analysiert, um potenzielle Modulatoren des c-di-GMP-Signalwegs in Bakterien zu identifizieren.

Protocol

1. Erzeugung eines grün fluoreszierenden Proteins (GFP), getaggt mit zyklischem di-GMP (c-di-GMP) Reporter, Pseudomonas aeruginosa, Stamm

1. 5 ml Medium mit Lysogenie-Bouillon (LB) mit einer einzigen Kolonie von P. aeruginosa beimpfen und über Nacht bei 37 °C und Schütteln bei 200 U/min inkubieren.
2. 2 ml der Übernachtkultur werden in 200 ml frisches LB-Medium in einem 1-l-Kolben überführt und bei 37 °C und Schütteln bei 200 U/min inkubiert.
3. Die optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) wird alle 30 min überwacht, indem eine 1-ml-Probe aus dem Kolben entnommen und mit einem Spektralphotometer unters....

Results

Abbildung 1. Eine 384-Well-Plattenkarte, die für den Small Molecule Screening Assay verwendet wird. Die Verbindungen aus der Bibliothek (hellblau) werden in die Vertiefungen A1-P22 aliquotiert. Die "Positivkontrolle" (rot), bestehend aus eine.......

Materials