Eine Technik zur Herstellung einer monoklonalen Bakterienkultur

Zusammenfassung

Quelle: Lin, P., et al. Synthese von Natriumwolframat und Natriummolybdat-Mikrokapseln über bakterielle Mineralausscheidung. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt die Vorbereitung einer monoklonalen Bakterienkultur für die Mineralproduktion durch serielle Verdünnung und Kolonieisolierung auf einer Agarplatte. Durch das Schütteln der Platte mit Glasperlen werden einzelne Zellen räumlich getrennt, um genetisch einheitliche Kolonien zu bilden, die dann zum Wachstum in flüssige Medien überführt werden. Es wird die Kultur mit der höchsten Trübung ausgewählt, was auf die dichteste monoklonale Population und das größte Potenzial für die Mineralproduktion hinweist.

Protokoll

1. Vorbereitung der Glasperlen

1. Geben Sie 100 Glasperlen mit einem Durchmesser von 3 mm in eine 100-ml-Laborflasche und verschließen Sie sie fest.
2. Autoklavieren Sie den Inhalt bei 120 °C für 10 min.
3. Lassen Sie die Flasche auf Raumtemperatur abkühlen und stellen Sie sie dann in die Biosicherheitswerkbank.

2. Zubereitung der Lysogenie-Bouillon (LB)

1. 8 g Pulver LB-Lennox Bouillon in einer 500 mL Laborflasche mit 400 mL Wasser auflösen.
2. Rühren Sie den Inhalt 20 Minuten lang mit einem Magnetrührstab aus Polytetrafluorethylen (PTFE) um und verschließen Sie ihn dann fest.
3. Autoklavieren Sie den Inhalt bei 120 °C für 10 min.
4. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und stellen Sie sie in die Biosicherheitswerkbank.
5. Aliquotieren Sie die Brühe mit einer Pipette in acht 15-ml-Zentrifugenröhrchen (je 12,5 ml) in der Biosicherheitswerkbank.
6. Aliquotieren Sie die restliche Brühe in drei 100-ml-Laborflaschen in der Biosicherheitswerkbank (je 100 mL). Verschließen Sie die drei Flaschen fest. Bewahren Sie sie in der Biosicherheitswerkbank auf.

3. Kultur von Shewanella-Algen

1. Verwenden Sie den tiefgefrorenen, kryokonservierten Stamm.
2. In der Biosicherheitswerkbank wird 1 ml des gefrorenen Materials mit einem Edelstahlspatel aus dem gefrorenen Röhrchen entnommen und in ein in Schritt 3.5 vorbereitetes Zentrifugenröhrchen gegeben.
3. Inkubieren Sie die Kulturen für 24 h in einem 37 °C Inkubator.

4. Zubereitung von LB-Lennox (Brühe mit Agar) Petrischalen

1. Lösen Sie zwei Tabletten LB-Lennox (Brühe mit Agar) in einer 100-ml-Laborflasche mit 100 mL Wasser auf.
2. Rühren Sie den Inhalt mit einem PTFE-Magnetrührstab 20 min lang um und verschließen Sie ihn dann fest.
3. Autoklavieren Sie den Inhalt bei 120 °C für 10 min.
4. In der Biosicherheitswerkbank aliquotieren Sie von Hand 100 ml Lösung in 4 Petrischalen und stellen Sie sicher, dass jede ~25 ml erhält. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen.

5. Vorbereitung von monoklonalen Bakterien

1. Beschriften Sie in der Biosicherheitswerkbank die drei Flaschen, die in Schritt 2.6, #1, #2 bzw. #3 vorbereitet wurden.
2. 0,1 mL der resultierenden Bakteriensuspension in Schritt 3.3 in Flasche #1 pipettieren. Verschließen Sie die Flasche und schwenken Sie sie 1 Minute lang mit der Hand, um eine homogene Lösung zu erhalten.
3. Pipettieren Sie 0,1 mL der resultierenden Bakterienflüssigkeit in Schritt 5.2 in Flasche #2. Verschließen Sie die Flasche und schwenken Sie sie 1 Minute lang mit der Hand, um eine homogene Lösung zu erhalten.
4. Pipettieren Sie 0,1 mL der resultierenden Bakterienflüssigkeit in Schritt 5.3 in Flasche #3. Verschließen Sie die Flasche und schütteln Sie sie 1 Minute lang mit der Hand, um eine homogene Lösung zu erhalten.
5. Pipettieren Sie die Flüssigkeit in Flasche #3 in die 4 Petrischale, die in Schritt 4.4 vorbereitet wurden, mit einem Volumen von je 0,02 ml.
6. Die in Schritt 1.3 vorbereiteten Glasperlen in die 4 verwendeten Petrischalen geben, je 4 Kügelchen.
7. Schließen Sie die Deckel der Petrischalen und schütteln Sie sie mit der Hand für 1 min.
8. Drehen Sie die Petrischalen auf den Kopf und inkubieren Sie sie 24 h lang in einem 37 °C heißen Inkubator.

6. Vermehrung monoklonaler Bakterien

1. Holen Sie sich 7 Röhrchen, die in Schritt 2.5 vorbereitet wurden.
2. Aus den in Schritt 5.8 vorbereiteten 4 Petrischalen mit einem Edelstahlspatel die entstandenen monoklonalen Bakterien herauspicken und in 7 Röhrchen separat füllen.
3. Lassen Sie die 7 Röhrchen 24 h in einem 37 °C heißen Inkubator.
4. Wählen Sie diejenige mit der größten Lichtstreuung mit der visuellen kolorimetrischen Methode aus.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
LB (Lennox-Brühe) mit Agar-Tabletten	Sigma-Aldrich	Nr. L7075	1 Tablette für 50 mL Brühe mit Agar
LB (Lennox-Brühe)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	LB (Lennox) Pulver 1 kg
Dextrose wasserfrei	Nihon Shiyaku Reagenz	PL 78695	Traubenzucker
50 mL Zentrifudgeröhrchen	Falke	14-432-22
15 mL Zentrifudgeröhrchen	Falke	14-959-53A
Laborflasche 100 mL	Duran	21 801 24 5
Laborflasche 500 mL	Duran	21 801 44 5
Spachtel aus rostfreiem Stahl	Chemglas	Nr. CG-1981-10
PTFE-Einweg-Rührstäbchen	Fischer	Nr. S68066
Petrischalen aus Kunststoff	Fischer	S33580A
Brutkasten	Kundenspezifisch	Sonderanfertigung	auf 40 °C erwärmen oder mit der Zeit auf 18 °C abkühlen
Biosicherheitswerkbank	Zong Yen co., LTD	ZYBH-420	Alle bakterienbezogenen Prozesse werden hier durchgeführt
Autoklav	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Taipeh City, Taiwan, ROC	TM-329	10 min auf 120 °C erhitzen