Synthese von Metalloxid-Mikrokapseln unter Verwendung metallreduzierender Bakterien

Zusammenfassung

Quelle: Lin, P., et al. Synthese von Natriumwolframat und Natriummolybdat-Mikrokapseln über bakterielle Mineralausscheidung. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Synthese von starren Metalloxid-Mikrokapseln durch Kultivierung metallreduzierender Bakterien mit Metallionen, gefolgt von einer sequentiellen Reinigung durch Beschallung, Zentrifugation und Ethanolwäsche.

Protokoll

ACHTUNG: Verwenden Sie für die Durchführung des Experiments Latexhandschuhe, eine Schutzbrille und einen Laborkittel. Schalten Sie bei jeder Verwendung der Biosicherheitswerkbank den Schranklüfter ein und halten Sie die Schranktür halb geschlossen.

1. Vorbereitung der Glasperlen

1. Geben Sie 100 Glasperlen mit einem Durchmesser von 3 mm in eine 100-ml-Laborflasche und verschließen Sie sie fest.
2. Autoklavieren Sie den Inhalt bei 120 °C für 10 min.
3. Lassen Sie die Flasche auf Raumtemperatur abkühlen und stellen Sie sie dann in die Biosicherheitswerkbank.

2. Zubereitung der Lysogenie-Bouillon (LB)

1. 8 g Pulver LB-Lennox-Bouillon in einer 500-ml-Laborflasche mit 400 mL Wasser auflösen.
2. Rühren Sie den Inhalt 20 Minuten lang mit einem Magnetrührstab aus PTFE (Polytetrafluorethylen) um und verschließen Sie ihn dann fest.
3. Autoklavieren Sie den Inhalt bei 120 °C für 10 min.
4. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und stellen Sie sie in die Biosicherheitswerkbank.
5. Aliquotieren Sie die Brühe mit einer Pipette in acht 15-ml-Zentrifugenröhrchen (je 12,5 ml) in der Biosicherheitswerkbank.
6. Aliquotieren Sie die restliche Brühe in drei 100-ml-Laborflaschen (je 100 mL) in der Biosicherheitswerkbank. Verschließen Sie die drei Flaschen fest und bewahren Sie sie in der Biosicherheitswerkbank auf.

3. Kultur von Shewanella-Algen

1. Verwenden Sie den tiefgefrorenen, kryokonservierten Stamm.
2. In der Biosicherheitswerkbank wird 1 ml des gefrorenen Materials mit einem Edelstahlspatel aus dem gefrorenen Röhrchen entnommen und in ein in Schritt 3.5 vorbereitetes Zentrifugenröhrchen gegeben.
3. Inkubieren Sie die Kulturen für 24 h in einem 37 °C Inkubator.

4. Zubereitung von LB-Lennox (Brühe mit Agar) Petrischalen

1. Lösen Sie zwei Tabletten LB-Lennox (Brühe mit Agar) in einer 100-ml-Laborflasche mit 100 mL Wasser auf.
2. Rühren Sie den Inhalt mit einem PTFE-Magnetrührstab 20 min lang um und verschließen Sie ihn dann fest.
3. Autoklavieren Sie den Inhalt bei 120 °C für 10 min.
4. In der Biosicherheitswerkbank aliquotieren Sie von Hand 100 mL der Lösung in 4 Petrischalen und stellen Sie sicher, dass jede ~25 mL erhält. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen.

5. Vorbereitung von monoklonalen Bakterien

1. Beschriften Sie in der Biosicherheitswerkbank die drei Flaschen, die in Schritt 2.6, #1, #2 bzw. #3 vorbereitet wurden.
2. 0,1 mL der resultierenden Bakteriensuspension in Schritt 3.3 in Flasche #1 pipettieren. Verschließen Sie die Flasche und schwenken Sie sie 1 Minute lang mit der Hand, um eine homogene Lösung zu erhalten.
3. Pipettieren Sie 0,1 mL der resultierenden Bakterienflüssigkeit in Schritt 5.2 in Flasche #2. Verschließen Sie die Flasche und schwenken Sie sie 1 Minute lang mit der Hand, um eine homogene Lösung zu erhalten.
4. Pipettieren Sie 0,1 mL der resultierenden Bakterienflüssigkeit in Schritt 5.3 in Flasche #3. Verschließen Sie die Flasche und schütteln Sie sie 1 Minute lang mit der Hand, um eine homogene Lösung zu erhalten.
5. Pipettieren Sie die Flüssigkeit in Flasche #3 in die 4 Petrischale, die in Schritt 4.4 vorbereitet wurden, mit einem Volumen von je 0,02 ml.
6. Die in Schritt 1.3 vorbereiteten Glasperlen in die 4 verwendeten Petrischalen geben, je 4 Kügelchen.
7. Schließen Sie die Deckel der Petrischalen und schütteln Sie sie mit der Hand für 1 min.
8. Drehen Sie die Petrischalen auf den Kopf und inkubieren Sie sie 24 h lang in einem 37 °C heißen Inkubator.

6. Vermehrung monoklonaler Bakterien

1. Holen Sie sich 7 Röhrchen, die in Schritt 2.5 vorbereitet wurden.
2. Aus den in Schritt 5.8 vorbereiteten 4 Petrischalen mit einem Edelstahlspatel die entstandenen monoklonalen Bakterien herauspicken und in 7 Röhrchen separat füllen.
3. Lassen Sie die 7 Röhrchen 24 h in einem 37 °C heißen Inkubator.
4. Wählen Sie diejenige mit der größten Lichtstreuung mit der visuellen kolorimetrischen Methode aus.

7. Zubereitung der LB-Lennox-Brühe mit Glukose und Salz

1. Geben Sie 10 g LB-Lennox-Brühe, 10 g NaCl und 10 g Glukose in eine 500-ml-Laborflasche. Fügen Sie Wasser hinzu, bis das Volumen 450 ml erreicht.
2. Rühren Sie den Inhalt mit einem PTFE-Magnetrührstab 20 min lang um.
3. Autoklavieren Sie den Inhalt bei 120 °C für 10 min.

8. Herstellung von Natriumwolframat

1. Geben Sie 16,5 g Natriumwolframat Na₂WO_{4,2H 2}O mit einem Edelstahlspatel in eine 100-ml-Laborflasche. Fügen Sie Wasser hinzu, bis das Volumen 50 ml erreicht.
2. Rühren Sie den Inhalt mit einem PTFE-Magnetrührstab 20 min lang um.
3. Autoklavieren Sie den Inhalt bei 120 °C für 10 min.
4. In der Biosicherheitswerkbank wird das Filtrat über einen Vakuumfilter aus Glasfaser mit Poren von 1 μm gewonnen.

9. Herstellung von LB mit Glukose, Salz und Natriumwolframat

1. Das in Schritt 8.4 gewonnene Filtrat wird in der Biosicherheitswerkbank von Hand in die in Schritt 7.3 hergestellte Lösung mit Glukose und Salz gegossen.
2. In der Biosicherheitswerkbank aliquotiert man mit einer Pipette die 500 mL resultierende Lösung in Schritt 9.1 in 10 x 50 mL Zentrifugenröhrchen.

10. Kultur von Bakterien

1. In der Biosicherheitswerkbank wird die in Schritt 6.4 vorbereitete Flüssigkeit entnommen und mit einer Pipette in die 10 in Schritt 9.2 vorbereiteten Reagenzgläser aliquotiert, wobei jedes Röhrchen 0,05 ml erhält.
2. Inkubieren Sie die 10 Röhrchen in einem 37 °C heißen Inkubator für 120 h.

11. Ernte von BME-Mineralien

1. Jede der 10 Röhren in Stufe 9.2 bei 20 KHz mit 150 W für 1 h beschallen.
2. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 2.025 x g für 1 h.
3. Entfernen Sie die klare Flüssigkeit in den Röhrchen mit einer Pipette, fügen Sie Wasser hinzu und wiederholen Sie dann die Schritte 11.1 und 11.2 noch einmal.
4. Entfernen Sie die klare Flüssigkeit in den Röhrchen mit einer Pipette, fügen Sie Alkohol hinzu und beschallen Sie sie dann bei 20 KHz mit 150 W für 1 h.
5. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 2.025 x g für 1 h.
6. Wiederholen Sie die Schritte 11.4 und 11.5 noch einmal
7. Ernten Sie BME-Mineralien, indem Sie die klare Flüssigkeit in den Röhrchen mit einer Pipette entfernen; Verschließen Sie die Röhrchen anschließend sofort, ohne einen Trocknungsprozess durchzuführen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
LB(Lennox)Brühe mit Agar-Tabletten	Sigma-Aldrich	Nr. L7075	1 Tablette für 50 mL Brühe mit Agar
LB (Lennox) Brühe	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	LB (Lennox) Pulver 1 kg
Dextrose wasserfrei	Nihon Shiyaku Reagenz	PL 78695	Traubenzucker
Natriumwolframat	Nihon Shiyaku Reagenz	PL 76050	Na2WO4 · 2H2O
Natriumchlorid	Nihon Shiyaku Reagenz	PL 68131	NaCl
Ethanol 99,5%	Acros Bio	AC615090040	CH3CH2OH
Wasser	Hergestellt in unserer Universität		Entionisiertes Wasser
Autoklav	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Taipeh City, Taiwan, ROC	TM-329	10 min auf 120 °C erhitzen
Zentrifuge	Digit System Laborsystem, Neu-Taipeh, Taiwan, ROC	DSC302SD	Zentrifuge bei 2025 x g
-80 °C Kühlschrank	Panasonic GmbH	MDF-U3386S	Zur Verwendung zum Tiefkühlen von kryokonservierten Stämmen
Ultraschall-Homogenisator Ultraschallator Prozessor Zell-Disruptor	Lenox	USV-150	Frequenz 20 KHz Leistung 150 W
Brutkasten	Kundenspezifisch	Sonderanfertigung	auf 40 °C erwärmen oder mit der Zeit auf 18 °C abkühlen
Reziproke Schüttelbäder	Kingtech Scientific Co., Ltd	WBS-L
Digitale Rührplatte	Corning	#6797-620D	Verwendung mit PTFE-Magnetrührstab
Biosicherheitswerkbank	Zong Yen co., LTD	ZYBH-420	Alle bakterienbezogenen Prozesse werden hier durchgeführt
50 mL Zentrifudgeröhrchen	Falke	14-432-22
15 mL Zentrifudgeröhrchen	Falke	14-959-53A
Laborflasche 100 mL	Duran	21 801 24 5
Laborflasche 500 mL	Duran	21 801 44 5
Spachtel aus rostfreiem Stahl	Chemglas	Nr. CG-1981-10
PTFE-Einweg-Rührstäbchen	Fischer	Nr. S68066
Petrischalen aus Kunststoff	Fischer	S33580A
Shewanella-Algen	Mit freundlicher Genehmigung des Autors #3	Mit freundlicher Genehmigung des Autors #3