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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Experimentelle Planung
- Beginnen Sie die Behandlung der Tiere mit einer Mundsonde nach 2 Tagen Akklimatisierung. Verwenden Sie eine Spritze mit der Sondennadel zum Einnehmen. 16 Ratten werden zwei Tage lang zweimal täglich mit Bacillus subtilis BSB3-Suspension (1 ml pro Ratte) behandelt (B. subtilis-Gruppe). 16 Ratten wurden zwei Tage lang zweimal täglich mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, PBS (1 ml pro Ratte) behandelt (PBS-Gruppe) (Abbildung 1).
- Nach der Behandlung wird jede Gruppe (8 Ratten pro Gruppe) unterteilt: Gruppe 1-Kontrolle (PBS/kein Stress), Gruppe 2-B. subtilis (B. subtilis /kein Stress), Gruppe 3-Stress (PBS/Hitzestress) und Gruppe 4-B. subtilis + Stress (B. subtilis/Hitzestress).
- Messen Sie die Rektaltemperatur jeder Ratte mit einem elektronischen digitalen Thermometer. Ratten der Gruppen 1 und 2 25 min bei Raumtemperatur halten. Die Tiere der Gruppen 3 und 4 werden 25 Minuten lang bei 45 °C und 55 % relativer Luftfeuchtigkeit in eine Klimakammer gebracht.
- Messen Sie anschließend die Rektaltemperatur jeder Ratte in allen Gruppen mit einem elektronischen Digitalthermometer. Stellen Sie alle Tiere für 4 Stunden bei Raumtemperatur auf.
- Betäuben Sie Ratten mit Isofluran (2 - 4%) in einem verschließbaren Anästhesiegefäß und beobachten Sie, bis die Ratten tief anästhesiert sind (keine Reaktion auf das Einklemmen der Zehen). Euthanasieren Sie Ratten durch schnelle Enthauptung mit einer Guillotine.
- Sammeln Sie das Stammblut jeder Ratte (15 - 16 ml) mit den apyrogenen Pipetten in apyrogene Röhrchen, um Serum zu erhalten, und entnehmen Sie sofort Blutproben (7 μl von jeder Ratte) mit einer Pipette zur mikroskopischen Untersuchung.
- Legen Sie die Röhrchen mit dem Blut für mindestens 30 Minuten in einen Kühlschrank, damit die Gerinnung möglich ist. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 20 °C, 7.000 x g für 10 min und entfernen Sie das Serum schnell mit einer Pipette. Das von jeder Ratte gewonnene Serum wird in ein Volumen von 50 μl aliquotiert und bis zum Assay bei -20 °C gelagert.
2. Chirurgischer Eingriff
- Schneiden/trimmen Sie das gesamte Fell vom Bauch und Brustkorb der Unterseite des Schlachtkörpers mit einer elektrischen Schere. Legen Sie den Schlachtkörper in einen sterilen Schrank und behandeln Sie die rasierte Oberfläche des Schlachtkörpers mit 70%igem Alkohol.
- Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um einen Mittellinienschnitt am Bauch zu erstellen. Entfernen Sie Leber, mesenteriale Lymphknoten, Milz und Dünndarm von jeder Ratte mit einer sterilen Pinzette.
3. Analyse der bakteriellen Translokation
- Geben Sie jede Probe von Leber, mesenterialen Lymphknoten und Milz in vorgewogene sterile Röhrchen und wiegen Sie. Berechnen Sie das Gewicht der Probe als Differenz zwischen dem Gewicht eines Röhrchens mit einer Probe und dem Gewicht eines leeren Röhrchens.
- Geben Sie steriles PBS in das Röhrchen, um eine Verdünnung von 1:10 (Gewicht pro Volumen, w/v) der Probe zu erhalten, und homogenisieren Sie jede Probe mit einem sterilen Glasgewebehomogenisator, um eine homogene Suspension zu erhalten.
- Führen Sie serielle Verdünnungen (10-1 bis 10-4) jeder Probe in sterilem PBS durch. Platte 0,1 ml aller Verdünnungen jedes Gewebes auf die Oberfläche von MacConkey's und 5% Blutagar und Brucella Blutagar mit Hämin (0,005 g/L) und Vitamin K1 (0,01 g/L) Platten.
- MacConkey-Agarplatten und 5%ige Blutagarplatten werden aerob und Brucella-Blutagarplatten unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C inkubiert.
- Zählen Sie Kolonien von aeroben Bakterien nach 24 Stunden und Kolonien von anaeroben Bakterien nach 48 Stunden Inkubation mit einem Koloniezähler. Drücken Sie die Ergebnisse als Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) in einem Gramm Gewebe aus.
