Herstellung und aerosolbasierte Ablagerung von Bacillus subtilis-Sporen

Zusammenfassung

Quelle: Fuchs, F. M., et al. Untersuchung der nachteiligen Auswirkungen der Niederdruck-Plasmasterilisation auf das Überleben von Bacillus subtilis-Sporen mittels Lebendzellmikroskopie. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt die Herstellung, Reinigung und aerosolbasierte Abscheidung von Bacillus subtilis-Sporen , um eine einheitliche Monoschicht zu erzeugen, die nachgelagerte Anwendungen wie die mikroskopiebasierte Analyse der Sporenkeimung, der Lebensfähigkeit oder der Stressreaktion ermöglicht.

Protokoll

1. Bacillus subtilis Sporenproduktion und -reinigung

1. Für die Sporenproduktion wird eine 5 mL Übernachtkultur des jeweiligen B. subtilis-Stammes , ergänzt mit geeigneten Antibiotika, auf 200 mL doppelt starkes flüssiges Schaeffer-Sporulationsmedium überführt (pro Liter 16 g Nährbrühe, KCl (Kaliumchlorid) 2 g, 0,5 g MgSO₄*7 H₂O (Magnesiumsulfat-Heptahydrat), 2 mL 1 M Ca(NO₃)₂ (Calciumnitrat), 2 mL 0,1 M MnCl₂ *• 4 H₂O (Manganchlorid-Tetrahydrat), 2 mL 1 mM FeSO₄ (Eisensulfat), 2 mL 50 % (w/v) Glukose18) und kultivieren Sie es unter kräftiger Belüftung bei 37 °C für 72 h oder bis > 95 % der Kultur gesporuliert sind. Es werden die Sporen der folgenden Stämme verwendet: B. subtilis PY79 (Wildtyp) B. subtilis PY79ΔrecA::neo (Mangel an DNA-Reparaturprotein RecA) B. subtilis PY79 recA-yfp::cat (RecA fusioniert mit gelb fluoreszierendem Protein [YFP]).
2. Ernten Sie die Sporen durch Zentrifugation für 15 min bei 3.000 x g in 50 mL-Röhrchen und reinigen Sie die Proben durch wiederholte Waschschritte (bis zu 15 Mal) mit steril destilliertem H₂O und überprüfen Sie die Reinheit und den Keimstatus durch Phasenkontrastmikroskopie. Stellen Sie sicher, dass die Sporensuspensionen aus phasenhellen Sporen bestehen (> 99 %) und frei von vegetativen Zellen (Stäbchen), gekeimten Sporen (schwarzes/graues Aussehen) und Zellresten sind; Andernfalls können weitere Mikroskopie-Experimente gestört werden. Waschen Sie die Probe, bis die gewünschte Reinheit erreicht ist.
3. Bestimmen Sie den Sporentiter durch Ausplattieren von 50 μL 10-facher Serienverdünnungen auf LB (Luria-Bertani)-Agar (d.h.: Verwenden Sie 30 μL Probe + 270 μL steriles Wasser für eine 1:10 Verdünnung. Man nehme 30 μl aus der jeweiligen Verdünnung auf 270 μl H₂O für eine Verdünnung von 1:100 usw.), um die KBE (koloniebildende Einheiten) zu berechnen und die Platten über Nacht bei 37 °C zu inkubieren. Nach der KBE-Bestimmung ist die Probe auf 10^{bis 9} Sporen pro ml einzustellen, indem sie konzentriert oder mit sterilem Wasser verdünnt wird.

2. Probenvorbereitung von aerosolabgelagerten Bacillus subtilis-Sporen

ANMERKUNG: Die Akkumulation und Überlappung von Sporen kann während der Behandlung zu Schatteneffekten führen, was letztendlich zu einer verfälschten Inaktivierungskinetik führt. Um dieses Problem zu minimieren, bereiten Sie Sporenproben durch eine Aerosolabscheidungstechnik vor. Kurz gesagt, steuern Sie die hochpräzise Zweistoffdüse mit einer elektrischen Zeitschaltuhr, die den Flüssigkeitsdurchsatz im Zusammenspiel mit der Strömung des unter Druck stehenden Trägergases (hier N₂) regelt. Dispergieren Sie die eingespritzte flüssige Probe durch den Düsenauslass unter Verwendung des Stickstoffgasstroms.

1. Legen Sie einen Probenträger in Form von sterilisierten mikroskopischen Objektträgern (für die Überlebenskinetik) oder runden 25 mm Deckgläsern (für die Fluoreszenzverfolgung von DNA-Reparaturprozessen/cLSM; konfokale Laserscanning-Mikroskopie) in das elektrisch betriebene Aerosol-Sprühgerät in Ausrichtung auf die Düse. Die verwendete Sporenkonzentration muss dem Hundertfachen der gewünschten Endkonzentration entsprechen.
2. Übertragen Sie 1 mL der Sporenkultur in den Düsenflüssigkeitseinlass und starten Sie den Sprühvorgang von 0,1 s bei einem Druck von 1,3 bar. Die versprühte Sporensuspension (1 x 10⁷) bildet auf dem Objektträger einen dünnen Film, der innerhalb von Sekunden schnell trocknet und eine gleichmäßig verteilte Sporenmonoschicht bildet. Lagern Sie die behandelten Probenträger in einem sterilen Behälter bei Raumtemperatur.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zweistoffdüse (Modell 970-8)	Schlick	14,404	230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0,8 mm Bohrungsdurchmesser
Luria Bertani Medium	Sigma Aldrich	70122-100G
Rohrverbinder	Festo	n/a	G 1/8
Objektträger aus Glas	VWR	48300-026
Attofluor-Zellkammer	Menzel, Fischer Ref.	3406816	d=25 mm, rund
Magnesiumsulfat-Heptahydrat	Sigma Aldrich	13152
Calciumnitrat	Sigma Aldrich	202967
Manganchlorid-Tetrahydrat	Sigma Aldrich	244589
Eisensulfat	AppliChem	13446-34-9
Traubenzucker	Merck	215422
Kaliumchlorid	Sigma Aldrich	P9541-500G
Nähr-Brühe (NB)	Merck	105443
Luria-Bertani (LB)	Merck	110283
96-Well-Platte	ThermoFisher	243656