Viabilitätsanalyse von Microcystis aeruginosa mittels Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Quelle: Chapman, I. J., et al., Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die Methode zur Unterscheidung von lebenden und toten Microcystis aeruginosa-Zellen durch die Kombination der Fluoreszenzsondenmarkierung mit der durchflusszytometrischen Analyse der Phycocyanin-Autofluoreszenz und des Sondensignals.

Protokoll

1. Optimierung der Aufnahme von molekularen Sondenzellen

1. Ernten Sie die Hälfte der M . aeruginosa-Kultur aus einer exponentiellen Phase und verwenden Sie sie als "lebende" Kontrolle.
   HINWEIS: Proben, die von einer Kultur mit hoher Dichte direkt in eine exponentielle Phase verdünnt werden, können die Optimierungsergebnisse durch den Umsatz toter Zellen im Vergleich zu Kulturen, die aus einer anfänglichen Verzögerungs-/Induktionsphase geimpft wurden, beeinflussen.
2. Bereiten Sie die andere Hälfte als "tote" Kontrolle vor, indem Sie Methoden wie 70 % Ethanol verwenden, indem Sie die Proben 1 Stunde lang auf 60 ^°C, Paraformaldehyd oder 4 % Formaldehyd für 30 Minuten erhitzen. Überprüfen Sie Schwankungen in der Mikroumgebung der Proben (z. B. pH-Wert).
   HINWEIS: Die positive, hitzeabgetötete, "tote" Kontrolle in M. aeruginosa unterscheidet sich von einer "lebenden" Probe durch ihre Abnahme der Phycocyanin-Signale. Die Induktion der Mortalität durch andere Methoden führt möglicherweise nicht zu der gleichen Leistung und variiert je nach Spezies.
3. Richten Sie gemischte Proben mit unterschiedlichen Verhältnissen von "lebenden" und "toten" Proben ein (z. B. 0 %, 25 %, 50 %, 100 %).
4. Disaggregieren Sie die Koloniebildung durch Vortexen oder Beschallung und prüfen Sie den pH-Wert.
5. Wählen Sie einen 488-nm-Laser neben Detektoren, die Fluoreszenz von den grünen (Fluoreszenzkanal 1 oder FL1, 530 ± 15 nm) und orangefarbenen (Fluoreszenzkanal 2 oder FL2, 585 ± 20 nm) Nukleinsäuresonden aufzeichnen können, und dem 640-nm-Laser, um Phycocyanin-Signale über den jeweiligen Detektor aufzuzeichnen.
   HINWEIS: Wenn sie an DNA gebunden ist, hat die grüne Nukleinsäuresonde eine ungefähre Fluoreszenzanregungswellenlänge von 504 nm und Emissionsmaxima von 523 nm, während die orangefarbene Nukleinsäuresonde eine Anregungswellenlänge von 547 nm und Emissionsmaxima von 570 nm hat. Ein 488-nm-Argon-Ionen-Festkörperlaser kann verwendet werden, um beide molekularen Sonden anzuregen, ein grüner Laser (bis zu 547 nm) erzeugt jedoch eine höhere orangefarbene Fluoreszenz.
6. Als Ausgangspunkt führen Sie die molekulare Sonde in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration in die 50 % "lebende" und 50 % "tote" Kultur ein und inkubieren Sie im Dunkeln.
7. Wählen Sie eine neue Datenzelle aus, und platzieren Sie die Probe unter dem Sample Introduction Port (SIP) mit Schwellenwerten und Triggern, die das Hintergrundrauschen reduzieren (FSC-H oder Forward Scatter Height, 80.000).
8. Erstellen Sie ein Dichtediagramm mit den Parametern FSC-H und SSC-H (Seitliche Streuhöhe) und drei Histogrammen. Ein Histogramm unter Verwendung des jeweiligen optischen Detektorkanals der Molekularsonde (FL1 oder 2), eines zum Nachweis von Phycocyanin-Emissionen (Fluoreszenzkanal 4 Höhe oder FL4-H) und das andere, FSC-H, alle auf einer logarithmischen Skala.
9. Inkubieren Sie die M . aeruginosa-Proben mit den Nukleinsäuresonden bis zu 60 Minuten lang im Dunkeln und zeichnen Sie sie in separaten Datenzellen zu verschiedenen Zeitpunkten (1, 5, 10, 15, 30 und 60 Minuten) auf.
   HINWEIS: Erkundigen Sie sich bei der Anpassung von Parametern wie dem pH-Wert bei den Herstellern nach möglichen Reaktionen bestimmter Chemikalien (bei den getesteten Nukleinsäuresonden darf ein Puffer keine Phosphate oder hohe Mengen an einwertigen oder zweiwertigen Kationen enthalten, da die Bindung an die DNA verringert wird).
10. Wenden Sie ein Software-Gate an, um nur das FSC-H-Histogramm (320.000 - 1.500.000) für die Zellgröße des Zielorganismus in das jeweilige Fluoreszenzsondenkanal-Histogramm aufzunehmen.
    HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Konzentrationen betrugen 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50 und 100 μM, die entweder durch Erhöhen oder Verringern des Volumens der M. aeruginosa-Probe oder der anfänglichen Stammlösung von Nukleinsonden geändert werden können.
11. Wenden Sie im Fluoreszenzsondenkanal ein weiteres inklusives Software-Gate auf den höchsten Peak im Histogramm an (grün FL1-H, 240.000 - 1.650.000, orange FL2-H, 30.000 - 165.000) und fügen Sie anschließend diese positive Sondenfluoreszenz in das Dichtediagramm ein.
12. Führen Sie die Schritte 3.1 - 3.11 mit 100 % "Lebend", 100 % "tot" und allen Mischkulturproben durch und passen Sie bei Bedarf die Molekülsondenkonzentrationen (z. B. x 0,1 bis x 10) und/oder die Temperatur und den pH-Wert an.
13. Vergleichen Sie die Anzahl der positiven Fluoreszenzsignale der Molekularsonde mit der ursprünglichen Zelldichte von "toten" Zellen (entnommen aus der Hälfte des gesamten FSC-H oder einer 100 % "toten" Kultur), um den Gesamtprozentsatz der Zellen zu ermitteln, die mit den Nukleinsäuresonden gefärbt wurden.
14. Führen Sie dies für jeden Zeitraum innerhalb jeder Konzentration durch, um das optimale Protokoll für den höchsten Prozentsatz der Zellnukleinsondenaufnahme zu finden, ohne eine unspezifische Färbung zu erzeugen (verwenden Sie die Mittelwerte in einer Einweg-Varianzanalyse, ANOVA oder Kruskal-Wallis-Einweg-Varianzanalyse, wenn die Daten nicht parametrisch sind).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Cyanobakterien Medien	Sigma-Aldrich	Nr. C3061-500ML	BG-11 Konzentrierte Süßwasserlösung (50x Verdünnung)
Dekontaminationsflüssigkeit	BD Biowissenschaften	653155	Bei Ausgaben von mehr als 12 Ereignissen pro Sekunde bei schneller Durchflussrate oder einer Durchflussrate von 66 μl/min 2 Minuten lang laufen. Gefolgt von 2 min Hülle H2O.
Durchflusszytometer	BD Biowissenschaften	auf Anfrage	BD Accuri C6
SYTOX Grün	Lebenstechnologien	Nr. S7020	Nukleinsäure-Färbung – 5 mM Lösung in DMSO
SYTOX Orange	Lebenstechnologien	Nr. S11368	Nukleinsäure-Färbung – 5 mM Lösung in DMSO