Bewertung der antimikrobiellen Aktivität von Nisin-Varianten mit einem Agar-Well-Diffusionsassay

Zusammenfassung

Quelle: Nickling, J. H., et.al. Antimikrobielle Peptide, die durch selektiven Druckeinbau von nicht-kanonischen Aminosäuren hergestellt werden. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt einen Agar-Well-Diffusionsassay, der zur Bewertung der antimikrobiellen Aktivität von Nisin-Varianten verwendet wird. Es wird gezeigt, wie Lactococcus lactis , der die membrangebundene Peptidase NisP exprimiert, die in E. coli produzierten Nisin-Vorläufer aktiviert, was zu wachstumshemmenden Halos führt. Die Größe dieser Halos spiegelt die Bioaktivität jeder Nisin-Variante wider.

Protokoll

1. Test der antimikrobiellen Aktivität

1. Präparation von GM17-Agarplatten unter sterilen Bedingungen
   1. Bereiten Sie eine Übernachtkultur des Indikatorstamms L. lactis NZ9000 mit Plasmid pNG nisPT bei 30 °C in M17-Bouillon mit 1 % (w/v) Glucose (=GM17) und 5 μg/ml Chloramphenicol vor.
   2. OD₆₀₀ messen, frisches Medium auf_{OD 600} = 0,1 impfen und bis OD₆₀₀ = 0,4-0,6 inkubieren. Stellen Sie dann den Kolben auf Eis.
      ANMERKUNG: Jede OD_600-Messung verbraucht Kulturvolumen. Beachten Sie, dass für jede Assay-Agarplatte 1 ml Bakterienkultur benötigt wird. Skalieren Sie bei Bedarf das Volumen der Flüssigkultur entsprechend hoch.
   3. Für 1,5 % Agar wiegen Sie 4,5 g Agar in einer Glasmedienflasche ab. 300 mL ddH₂O zugeben, mischen und autoklavieren.
   4. 2x M17 Bouillon (zweifach konzentriert) in 300 mL ddH₂O zubereiten und autoklavieren.
   5. Mischen Sie 25 mL 2x M17 Bouillon mit 10 μg/mL Chloramphenicol und 2% Glukose mit 1 mL L . lactis Vorkultur (4% v/v).
   6. Fügen Sie 25 ml geschmolzenen 1,5%igen Agar hinzu (frisch autoklaviert oder in der Mikrowelle erhitzt).
      ANMERKUNG: Lassen Sie die Flasche zuvor bei Berührung abkühlen (ca. 50 °C). Dies ist notwendig, da L. lactis ein mesophiler Organismus ist, der empfindlich auf hohe Temperaturen reagiert.
   7. Gieße die Lösung in eine große Petrischale. Platten 10-15 Min. trocknen.
   8. Sterilisieren Sie die Enden einer Pasteurpipette aus Glas durch Flamme. Warten Sie, bis es abgekühlt ist, und verwenden Sie dann das breite Ende, um Löcher in das erstarrte GM17-Agar zu bohren.
2. Probenvorbereitung
   1. Nehmen Sie 1 ml der E. coli-Expressionskulturen in ein markiertes 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie 3 Minuten lang bei 7.000 x g. Das restliche Medium aspirieren und das Zellpellet in 500 μL Na-P (50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4 aus 0,5 M Natriumdihydrogenphosphat und 0,5 M Dinatriumhydrogenphosphat) resuspendieren.
   2. Beschallen Sie die Proben auf Eis. Tauchen Sie die Spitze der Ultraschallsonde in die Zellsuspension. Stellen Sie den Ultraschallator auf 30 % Amplitude mit einem Impuls von 1 s ein und 5 s aus für 3 min ein.
   3. Zentrifugieren Sie das Zelllysat 10 Minuten lang bei 13.000 x g, um Zellreste zu pelletieren. Den Überstand in ein neues Reaktionsgefäß auf Eis überführen.
   4. Verdünnen und normalisieren Sie die Überstände des Zellextrakts auf 1 mL OD₆₀₀ = 0,6, bezogen auf die geerntete Zelldichte, mit Na-P.
3. Aktivitätstest
   1. Geben Sie 40 μl jeder normalisierten Probe in ein Loch der Indikator-Agarplatte (Abbildung 1). Verwenden Sie Chloramphenicol in einer Menge von 400 μg/ml als antibakterielle Kontrollverbindung. Verwenden Sie den Elutionspuffer als Negativkontrolle. Warten Sie, bis alle Proben in den Agar diffundiert sind. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 30 °C.
   2. Machen Sie Fotos von den Agarplatten mit einem Flachbettscanner oder einer Digitalkamera. Die Größe des Halos zur Wachstumshemmung kann von Hand oder mit ImageJ gemessen werden.

Ergebnisse

Abbildung 1. Antimikrobieller Aktivitätsassay von Zelllysaten, die Nisin-Varianten enthalten, die über SPI mit Prolinanaloga hergestellt wurden. Vergleich von Nisin-Varianten mit rekombinanten Wildtyp-Pr...

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