Messung des kinetischen Isotopeneffekts auf den mikrobiellen Elektronentransport mit Hilfe von Deuteriumoxid

Zusammenfassung

Quelle: Tokunou, Y., et al., Elektrochemischer Nachweis des deuteriumkinetischen Isotopeneffekts auf den extrazellulären Elektronentransport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt eine elektrochemische Ganzzellmethode, um zu beurteilen, wie sich der Protonentransfer auf den extrazellulären Elektronentransport (EET) in elektroaktiven Bakterien auswirkt. Durch das Ersetzen von Protonen durch Deuteronen unter Verwendung von Deuteriumoxid misst die Methode Stromänderungen, um einen kinetischen Isotopeneffekt aufzudecken, was die Rolle der Protonenbewegung bei der Regulierung des Elektronenflusses hervorhebt.

Protokoll

1. Zugabe von Deuteriumwasser zur Messung des KIE im EET-Prozess (Abbildung 1)
   1. Bestätigen Sie, dass die derzeitige Produktion aus einem Monolayer-Biofilm von Shewanella oneidensis MR-1 stabil ist und nicht schnell zunimmt. Wenn der Strom stark ansteigt, warten Sie, bis sich der Strom innerhalb eines Anstiegs von 5 % über 10 Minuten stabilisiert hat, indem Sie pendelnde Elektronenmediatoren wie 100 μM Anthrachinon-1-sulfonat (α-AQS) hinzufügen.
      ANMERKUNG: Die Bildung eines Monolayer-Biofilms auf einer Indiumzinn-dotierten Oxid (ITO)-Elektrode ohne Kontamination durch andere mikrobielle Stämme wurde durch rDNA-Sequenzen und eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme des Biofilms auf einer ITO-Elektrode bestätigt. Um die Geschwindigkeitsbegrenzung durch den EET-Prozess zu bestätigen, überwachen Sie die Wirkung der Zugabe von Shuttling-Elektronenmediatoren wie 100 μM Anthrachinon-1-Sulfonat (α-AQS).
   2. 40 μl anoxisches 50 % (v/v) D₂O werden mit einer Spritze so in den elektrochemischen Reaktor gegeben, dass die Konzentration im Reaktor 0,5 % (v/v) D₂O beträgt.
      ANMERKUNG: Um eine Schädigung des Biofilms durch D₂O Zugabe zu vermeiden, injizieren Sie das D₂O tropfenweise.
   3. Warten Sie, bis sich der Strom stabilisiert hat, und fügen Sie anschließend den D₂O bis zu 4,0 % (v/v) hinzu.
      ANMERKUNG: Um den KIE-Wert (das Verhältnis der aktuellen Produktion in Gegenwart von D₂O und H₂O) zu erhalten, ist zu prüfen, wie sich die gleiche Menge an H₂O-Zugabe auf die aktuelle Produktion auswirkt.

Ergebnisse

Abbildung 1: Einfluss der_D2O-Zugabeauf die aktuelle Produktion aus einem Monolayer-Biofilm von S. oneidensis MR-1. Zeit im Vergleich zur aktuellen Produktion für einen Monolayer-Biofilm von S. oneidensis MR-1 in einem elek...

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