Herstellung von künstlichem Sputummedium zur Emulation von Mukoviszidose Lungenauswurf ex vivo

Zusammenfassung

Quelle: Vieira, J., et al. Design und Entwicklung eines Modells zur Untersuchung der Wirkung von zusätzlichem Sauerstoff auf das Mikrobiom der Atemwege von Mukoviszidose. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video zeigt die Herstellung eines künstlichen Sputummediums, das die Viskosität, die Nährstoffzusammensetzung und den pH-Wert des Mukoviszidose-Lungenauswurfs nachahmt. Das resultierende Medium bietet eine physiologisch relevante Plattform für ex vivo-Studien.

Protokoll

1. Zubereitung von künstlichem Sputummedium

ANMERKUNG: Die hier aufgeführten Mengen gelten für die Herstellung von 1 l künstlichem Endsputummedium und gehen von den spezifischen Reagenzien aus, die in der Materialtabelle aufgeführt sind. Die Nummern müssen für andere Volumina oder für die Verwendung unterschiedlicher Reagenzien angepasst werden, um das gleiche Endprodukt zu gewährleisten. Siehe Tabelle 1 für die Zielkonzentrationen.

1. Chemischer Mix aus künstlichem Sputum (ASCM)
   ANMERKUNG: ASCM macht 25 % des endgültigen Mediumvolumens aus. Es ist lagerstabil und kann in loser Schüttung oder im Voraus zubereitet werden. Wenn Sie die Chemikalienmischung für die spätere Verwendung vorbereiten, autoklavieren Sie sie und lagern Sie sie sicher bei Raumtemperatur.
   1. Mischen Sie die chemischen Stammlösungen.
      1. Bereiten Sie 1 M NaCl-Brühe vor: Fügen Sie 58,44 g NaCl pro Liter sterilem Wasser hinzu.
      2. Bereiten Sie 1 M KCl-Brühe vor: Fügen Sie 74,55 g KCl pro Liter sterilem Wasser hinzu.
      3. Bereiten Sie 1 M MgSO₄ Brühe vor: Fügen Sie 246,47 g MgSO_{4,7H 2}O pro Liter sterilem Wasser oder 120,37 g wasserfreies MgSO₄ pro Liter steriles Wasser hinzu.
      4. Bereiten Sie 1 M Glukosebrühe vor: Fügen Sie 180,16 g Glukose pro Liter sterilem Wasser hinzu.
   2. Sterilisieren Sie die chemischen Stammlösungen sowie eine leere 250-ml-Flasche im Autoklavier. Führen Sie die Autoklavierschritte 30 Minuten lang auf mindestens Standardwerte von 121 °C und 15 PSI durch.
   3. Geben Sie 80,59 ml steriles Wasser in die leere 250-ml-Flasche.
   4. Fügen Sie der Mischung 152,30 ml 1 M NaCl-Stamm hinzu.
   5. Fügen Sie der Mischung 15,8 mL 1 M KCl-Stamm hinzu.
   6. 610 μl 1 M MgSO₄ Stamm zu der Mischung hinzufügen.
   7. Fügen Sie der Mischung 700 μl 1 M Glukosebrühe hinzu.
2. Künstlicher Sputum-Muzin-Mix (ASMM)
   ANMERKUNG: ASMM macht 50 % des endgültigen Mediumvolumens aus. Stellen Sie sicher, dass sie am selben Tag wie die endgültige Charge des Mediums zubereitet wird.
   1. Geben Sie 450 ml steriles Wasser in eine leere 1-Liter-Flasche.
   2. Geben Sie 50 mL 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Flasche.
   3. Füge einen magnetischen Einwegrührstab in die Flasche ein.
   4. Autoklavieren Sie die Flasche mit PBS und den Rührstab.
   5. Messen Sie 10 g Muzinpulver ab und geben Sie es zum PBS.
   6. Schütteln Sie die Flasche zum Vormischen kräftig.
   7. Stellen Sie die Flasche mit einem Magnetrührer auf eine heiße Platte. Stellen Sie die Hitze auf mittlere bis hohe Stufe mit 50 °C und die Rührgeschwindigkeit auf 1100 U/min ein. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit schrittweise, damit die Stange nicht vom Magneten fliegt.
      1. 15 Min. erhitzen und rühren.
      2. Heben Sie die Flasche mit hitzebeständigen Handschuhen auf. Beobachten Sie, ob sich das Muzinpulver aus der Lösung absetzt.
      3. Wenn sich das Muzinpulver nicht vollständig aufgelöst hat, stellen Sie die Flasche für 5-Minuten-Intervalle wieder auf den Herd/Rührer, bis sie vollständig aufgelöst ist.
   8. Lassen Sie die Muzinmischung auf Raumtemperatur abkühlen.
3. Biologischer Mix aus künstlichem Sputum (ASBM)
   ANMERKUNG: ASBM beträgt 25 % des Endvolumens des Mediums. Bereiten Sie es am selben Tag wie die endgültige Charge des Mediums zu und setzen Sie seine Bestandteile im Gegensatz zu den anderen Mischungen keiner Hitze aus.
   1. Tauen Sie die 100x Vitaminbrühe im 4 °C Kühlschrank oder auf Eis auf. ​
      ANMERKUNG: Portionieren Sie die Vitaminbrühe in 10-ml-Aliquoten, um die Anzahl der Gefrier-/Auftauzyklen zu minimieren.
   2. Geben Sie 124,24 ml steriles Wasser in die leere autoklavierte 250-ml-Flasche.
   3. Fügen Sie der Mischung 25,76 ml 50x essentielle Aminosäurebrühe hinzu.
   4. Fügen Sie der Mischung 80,14 ml 100x nicht-essentielle Aminosäurebrühe hinzu.
   5. Fügen Sie der Mischung 10 ml (aufgetaute) 100x Vitaminbrühe hinzu.
   6. Fügen Sie der Mischung 1 ml 1000x Spurenmetalle hinzu.
   7. Fügen Sie der Mischung 8,33 ml 30%ige Eigelbemulsion hinzu.
   8. Fügen Sie der Mischung 400 μl 10 g/l Ferritinbrühe hinzu.
   9. Mischen Sie die Lösung durch manuelles Schütteln gut.
4. Künstliches Sputummedium (ASM)
   1. Geben Sie 250 mL ASCM in die 1-Liter-Flasche mit ASMM.
   2. Geben Sie 250 mL ASBM in die mittlere Flasche.
   3. Titrieren Sie das Medium mit basischem MOPS-Puffer (1 M), um einen pH-Wert von 6,3 auf einem dünnen pH-Papier zu erreichen. Vor der Titration ist die Mediummischung zu sauer.
   4. Das entstandene künstliche Sputummedium bei 4 °C kühlen, bis es filtrierbar ist.
   5. Um den Filtrationsprozess zu starten, geben Sie 200 mL ungefiltertes künstliches Sputummedium in ein Vakuumfiltrationssystem mit einem Filter mit einer Porengröße von 0,22 μm.
   6. Schließen Sie das Filtersystem an die Vakuumpumpe an, schalten Sie die Vakuumpumpe ein, stellen Sie sie auf 70 mbar ein und stellen Sie die Kammer dann auf einen Orbitalschüttler, der bei 90 U/min in einem Kühlraum bei 4 °C geschüttelt wird.
      1. Füllen Sie mit weiteren 150 mL des Mediums auf, da eine nennenswerte Menge gefiltert wird. Es dauert 1-2 Tage, um 1 L Medium vollständig zu filtrieren.
      2. Wiederholen Sie den Vorgang mit zusätzlichen Kammern, bis das gesamte Medium gefiltert ist.
         ANMERKUNG: Versuchen Sie, nicht mehr als 350 ml des Mediums durch denselben 0,22-μm-Filter zu filtern, da Mucin den Filter mit der Zeit verstopft.
   7. Gefiltertes künstliches Sputummedium bis zur Verwendung bei 4 °C kühlen. Verwenden Sie ASM innerhalb eines Monats nach der Vorbereitung, um die besten Ergebnisse zu erzielen.

Tabelle 1: Rezeptur für künstliches Sputummedium, abgeleitet aus der Literaturrecherche. (Spalte 1) Reagenzien und Schlüsselwerte bei der Formulierung von künstlichem Sputummedium. (Spalten 2-7) Vergleich von Rezepten aus der vorhandenen Literatur. (Spalten 8-9).

Spalte 1		Spalte 2	Spalte 3	Spalte 4	Spalte 5	Spalte 6	Spalte 7	Spalte 8	Spalte 9
Wert		Comstock	Kirchner	Sriramulu	Palmer	Flynn	Gallagher	Lai	Quelle
Muzin		2% w/v	0,5 % Gew/V	0,5 % Gew/V	-	1 % w/v	2% w/v	1 % w/v	Flynn
Natriumchlorid		85,5 mM	85,5 mM	85,5 mM	66,6 Mio. Mio.	89,8 Mio. Mio.	85,5 mM	ca. 152,3 Mio. m	Lapierre
Kaliumchlorid		ca. 29,5 Mio.	ca. 29,5 Mio.	ca. 29,5 Mio.	ca. 15,8 Mio.	-	ca. 2,95 Mio.	ca. 15,8 Mio.	Palmer
Magnesiumsulfat		-	-	-	0,6 mM	1 mM	1 mM	0,61 mM	Palmer
Eisensulfat		-	-	-	0,0036 mM	-	-	-	-
Ammoniumchlorid		-	-	-	ca. 2,3 Mio. m	60 mM	-	-	-
Monokaliumphosphat		-	-	-	ca. 2,5 Mio. m	60 mM	-	-	-
Traubenzucker		-	-	-	3,2 Mio. m	ca. 13 Mio.	40 mM	0,7 Mio. m	Sambeek
Lactat		-	-	-	9 mM	-	-	-	-
Essentielle Aminosäuren		14,45-mal	0,25 g/L	0,25 g/L	Pro Säure	0,5-fach	0,375-mal	1,29-fach	Palmer
Nicht-essentielle Aminosäuren		28,9-fach	0,25 g/L	0,25 g/L	Pro Säure	0,25-fach	0,5-fach	8,01-fach	Palmer
Vitamine		-	-	-	-	-	1x	1x	Gallagher
Spurenmetalle		-	-	-	-	1x	1x	1x	Flynn
Eigelb		0.25%	0.25%	0.25%	-	-	0.25%	0.25%	Kirchner
Ferritin		0,0003 g/L	-	-	-	-	0,0004 g/L	0,0004 g/L	Gallagher
Lachs-Spermien-DNA		1,4 g/l	4 g/L	4 g/L	-	-	1,4 g/l	-	-
DPTA		-	-	0,0059 g/l	-	-	-	-	-
Ph		-	6.9	-	6.8	-	-	6.3	Lapierre
Lagerung		0	4°	-	-	4°	4°	4°	Kirchner
Sterilisation		Autoklav	Filter	Autoklav	-	Autoklav	Autoklav	Filter	Kirchner

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BME-Vitamine (100x) Lösung	MilliporeSigma	Nr. B6891	Konzentrierte Lösung von ergänzenden Vitaminen.
Crimpzange, 30 mm	DWK Lebenswissenschaften	224307	Crimpzange zum Anbringen von Aluminiumdichtungen an Serumflaschen.
D-(+)-Glukose	MilliporeSigma	Nr. G7021	Festes Glukosepulver (rechtsdrehendes Isomere).
Membranpumpe ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	Vakuumpumpe für die Vakuumfiltration.
Eigelb-Emulsion	HiMedia	Nr. FD045	Sterile Emulsion aus 30% Eigelb in Kochsalzlösung.
Ferritin, kationisiert aus der Pferdemilz	MilliporeSigma	Nr. F7879	Ferritin-Lösung (Eisenspeicherprotein).
FIREBOY plus Sicherheits-Bunsenbrenner	Integra Biowissenschaften	144000	Bunsenbrenner mit Benutzeroberfläche und Sicherheitsfunktionen.
Hydrion pH-Papier (1,0–14,0)	Micro Essential Labor	94	pH-Testpapier für den Bereich von 1,0–14,0.
Hydrion pH Papier (4,0–9,0)	Micro Essential Labor	55	pH-Testpapier für den Bereich von 4,0–9,0.
Hydrion pH-Papier (6,0–8,0)	Micro Essential Labor	345	pH-Prüfpapier für den Bereich von 6,0–8,0.
Injektionsnadel-Pro EDGE Sicherheitsvorrichtung, 18 g	Smiths Medizin	401815	18 G Nadeln mit Sicherheitskappen.
Inline-Manometer	MilliporeSigma	20469	Gasdruckmessgerät zur Überwachung des Flaschendrucks.
Innova 42 Inkubator-Schüttler	Eppendorf	2231000756	Kombination aus Inkubator/Orbitalschüttler.
Luer-Lok Spritze mit aufgesetzter Nadel	Becton Dickinson	309580	Kombination aus 3 mL Spritze und 18 G Nadel.
Luer-Ventil-Sortiment	Welt Präzisionsinstrumente	14011	Ventile für Gasdurchflussschläuche.
LSE Orbitalschüttler	ThermoFisher Scientific	6780-NP	Orbitalschüttler zum Rühren von Medien während der Filtration.
Magnesiumsulfat-Heptahydrat	MilliporeSigma	Nr. M2773	Festes Bittersalz (Magnesiumsulfat-Heptahydrat).
Einstufiger Regler für medizinische Luft mit Durchflussmesser	Westliche Unternehmen	M1-346-15FM	Luftmengenregler mit 15 L/min Meter.
MEM-Aminosäuren (50x) Lösung	MilliporeSigma	M5550	Konzentrierte Lösung von essentiellen Aminosäuren.
MEM nicht-essentielle Aminosäuren (100x) Lösung	MilliporeSigma	M7145	Konzentrierte Lösung von nicht-essentiellen Aminosäuren.
Millex-GP Filter, 0,22 μm	MilliporeSigma	SLMP25SS	0,22 μm Polyethersulfonmembran steriler Spritzenvorsatzfilter.
Milli-Q Akademisch	MilliporeSigma	ZMQS60E01	Milli-Q Sterilwasser-Filtersystem.
MiniOX 3000 Sauerstoffmonitor	MSA	814365	Überwachung des Sauerstoffgehalts des Gasflusses.
MOPS-Puffer (1 m, pH 9,0)	Boston BioProducts	BBM-90	MOPS-Puffer zur Einstellung des pH-Werts des Mediums.
Mucin aus dem Schweinemagen	MilliporeSigma	Nr. M2378	Muzin (glykosyliertes gelbildendes Protein) Pulver.
Kaliumchlorid	MilliporeSigma	Nr. P9541	Festes Kaliumchloridsalz.
PTFE-Einweg-Rührstäbchen	ThermoFisher Scientific	14-513-95	Einweg-Magnetrührstäbchen.
PTFE-Gewindedichtung Teflonband	VWR	470042-938	Teflonband zur Verstärkung von Gasanschlüssen.
Q-Gard 2 Aufreinigungskartusche	MilliporeSigma	QGARD00D2	Aufreinigungskartusche für das Milli-Q System.
Wiederverwendbare Medien-Aufbewahrungsflaschen	ThermoFisher Scientific	06-423A	Flaschen zum Mischen und Aufbewahren von Nährmedien.
Gummistopfen, 30 mm, Grau Bromobutyl	DWK Lebenswissenschaften	224100-331	Gummistopfen für Serumflaschen.
Serumflasche mit geformten Graduierungen, 500 mL	DWK Lebenswissenschaften	223952	Serumflaschen aus Glas für die versiegelte Kultivierung.
Verlängerungsset mit kleinem Durchmesser	Braun Medizin	471960	Schlauchverlängerung mit Luer-Lock-Anschlüssen.
Natriumchlorid	MilliporeSigma	Nr. S3014	Festes Natriumchloridsalz.
Spurenmetall-Gemisch, 1000x	ThermoFisher Scientific	NC0112668	Konzentrierte Lösung physiologischer Spurenmetalle.
Ungefütterte Aluminiumdichtung, 30 mm	DWK Lebenswissenschaften	224187-01	Aluminiumdichtungen, die über Gummistopfen gecrimpt sind.