Quantifizierung koloniebildender Einheiten darmassoziierter Bakterien in Drosophila-Fliegen

Zusammenfassung

Quelle: Dodge, R., et al. Schnelle Zählung von koloniebildenden Einheiten im 96-Well-Plattenformat, angewendet auf das Drosophila-Mikrobiom . J. Vis. Exp. (2023)

Dieses Video zeigt die Quantifizierung von koloniebildenden Einheiten (KBEs) von darmassoziierten Bakterien in Drosophila-Fliegen unter Verwendung eines seriellen Verdünnungs- und Plattierungsansatzes. Homogenisierte Fliegenproben, die Darmbakterien enthalten, werden seriell verdünnt, auf Agar plattiert und inkubiert, um das Wachstum der Kolonie zu ermöglichen. Die Bilder der Platten werden dann mit Hilfe einer Software analysiert, um die Kolonien an jedem Punkt auszurichten, zu segmentieren und zu zählen, was eine genaue KBE-Quantifizierung ermöglicht.

Protokoll

1. Individuelle Homogenisierung von Fliegen in einer 96-Well-PCR-Platte

1. Bereiten Sie die Teller für die Rührplatten im Voraus vor.
   1. Gießen Sie 0,5 μm Glasperlen (siehe Materialtabelle) auf die Bead-Messschale. Verteilen Sie die Kügelchen auf der Schale, so dass alle Vertiefungen voll und eben sind, und bürsten Sie dann überschüssige Kügelchen in ein konisches Rohr ab, um sie aufzufangen.
   2. Legen Sie eine Polymerase-Kettenreaktionsplatte (PCR) mit halbem Rand (siehe Materialtabelle) kopfüber auf das Messtablett und richten Sie sie mit den Vertiefungen aus, indem Sie sie in die Vertiefung auf dem Tablett einsetzen. Drehen Sie es dann schnell um, um die Perlen zu übertragen.
   3. Entfernen Sie überschüssige Kügelchen von der Oberfläche der PCR-Platte und decken Sie sie mit Folie ab. Überprüfen Sie die PCR-Platte, um sicherzustellen, dass alle Vertiefungen Kügelchen enthalten. Verwenden Sie bei Bedarf einen Wiegelöffel, um Perlen in eine einzelne Vertiefung zu geben. Wenn statische Elektrizität dazu führt, dass Kügelchen an den Plattenoberflächen haften bleiben, wischen oder besprühen Sie die Rückseite des Messtabletts und der PCR-Platte mit 70 % Ethanol.
   4. Mit Alufolie abdecken. Viele Platten können auf diese Weise vorbereitet und anschließend autoklaviert und für die spätere Verwendung gelagert werden. Wenn Sie gebrauchsfertig sind, geben Sie mit dem 96-Kanal-Pipettierer 100 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in jede Vertiefung (siehe Materialtabelle).
2. Oberflächensterilisieren Sie die mikrobenbesiedelten Fliegen vor der Homogenisierung mit 70% Ethanol.
   1. Betäuben Sie die Fliegen 5 s lang mit 100% CO₂ . Übertragen Sie anästhesierte Fliegen aus dem Fläschchen mit einem kleinen Trichter in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Abbildung 1A-2). In dieser Studie wurden typischerweise 25 Fliegen pro Röhrchen hinzugefügt.
   2. Sprühen Sie sofort ~1 ml 70% Ethanol in das Röhrchen, schließen Sie das Röhrchen und mischen Sie es 10 s lang durch Inversion. Aspirieren Sie dann das Ethanol mit einer P1000-Pipette und achten Sie darauf, keine Fliegen zu aspirieren. Wiederholen Sie den Vorgang erneut mit Ethanol und dann zweimal mit sterilem PBS (Abbildung 1A-3).
3. Nach der letzten PBS-Wäsche schließen Sie die Tube und klopfen Sie mit der Kappenseite nach unten einige Male fest auf die Bank, damit die Fliegen in die Kappe gelangen.
4. Öffnen Sie das Röhrchen und geben Sie die Fliegen mit einer Pinzette in die Vertiefungen ab (Abbildung 1A-4). Platzieren Sie eine Fliege in jeder Vertiefung (Abbildung 1A-5). Halten Sie die Platte während des Beladens auf Eis, um die Fliegen betäubt zu halten.
5. Versiegeln Sie die Platte mit einer Thermal Bond-Heißsiegelfolie (siehe Materialtabelle).
   1. Entfernen Sie zunächst alle verirrten Kügelchen, die sich in der Nähe der Vertiefungen befinden, da diese zu Undichtigkeiten in der Folienversiegelung führen können. Achte darauf, dass die stumpfe Seite der Folie nach unten auf der Platte und die glänzende Seite nach oben zum Heißsiegelgerät zeigt. Drücken Sie das Heißsiegelgerät (siehe Materialtabelle) 5 s lang fest nach unten (Abbildung 1A-6). Mit dem Handapplikator (siehe Materialtabelle) polieren, um die Folie zu fixieren.
      HINWEIS: Eine schlechte Abdichtung ist eine Ursache für Probenverlust.
6. Befestigen Sie die Platte im Plattenschüttler. 5 min lang homogenisieren (Abbildung 1A-7). Die Raupenplatte in einem Mini-Plattenschleuder (siehe Materialtabelle) 30 s lang bei 350 x g eindrehen, um Flüssigkeit aus der Siegelfolie zu entfernen.
7. Entfernen Sie die Folie, während Sie die Platte festhalten, um keine Tröpfchen mit Fliegenhomogenat aus den Vertiefungen zu spritzen.

2. Serielle Verdünnung von Fliegenhomogenat und Fleckenbildung auf CFU-Platten

1. Legen Sie vier rechteckige Wachstumsplatten aus De-Man-, Rogosa- und Sharpe-Agar (MRS) (siehe Materialtabelle) in die Biosicherheitswerkbank und entfernen Sie deren Deckel. In diesem Protokoll wurde MRS-Agar für das Wachstum von L. plantarum verwendet. Lassen Sie diese Platten mindestens 10 Minuten trocknen (20 Minuten, wenn sie frisch gegossen oder kalt aus der Lagerung kommen).
   HINWEIS: Wenn die Platten nass sind, laufen die Tröpfchen von der 96-Well-Platte zusammen und ruinieren die Zählungen.
2. Bereiten Sie drei Verdünnungsplatten vor, indem Sie 100 μl PBS mit einer 96-Kanal-Pipettore in jede Vertiefung einer sterilen 96-Well-Platte geben. Legen Sie ein Gestell mit P20-Spitzen auf die 96-Kanal-Pipette.
3. Eine Verdünnung im Verhältnis 1:10 wird durch Aspirieren von 11,1 μl Homogenat aus der in Abschnitt 1 vorbereiteten Probenplatte vorgenommen (Abbildung 1A-8). Achten Sie darauf, aus der Mitte der Vertiefungen und nicht vom Boden der Vertiefungen zu ziehen, da das Fliegenhomogenat und die Glasperlen die Pipetten verstopfen. Die Kügelchen sinken ab, und die Fliegenpartikel schwimmen, so dass die mittlere Schicht weitgehend frei bleibt.
4. Geben Sie die 11,1 μl in die erste Verdünnungsplatte, die bereits 100 μl steriles PBS pro Vertiefung enthält. Lassen Sie die Verdünnungsplatte 10 s lang bei 600 Umdrehungen pro Minute (U/min) auf dem Plattenschüttler. Mischen Sie erneut, indem Sie fünf Zyklen lang auf und ab pipettieren. Übertragen Sie 11,1 μl von der ersten Verdünnungsplatte auf die zweite Verdünnungsplatte und wiederholen Sie die Mischschritte für die nächsten beiden Verdünnungsplatten.
5. Führen Sie die Verdünnungsreihenbeschichtung wie unten beschrieben durch.
   1. Entnehmen Sie die Wachstumsfugen aus der Biosicherheitswerkbank.
   2. Beginnen Sie mit der am stärksten verdünnten Platte, und geben Sie mit der 96-Well-Pipetette 2 μl aus jeder Vertiefung auf die Agarplatten (Abbildung 1A-9).
      1. Senken Sie den Pipettenkopf langsam auf die Platte und achten Sie darauf, nicht in den Agar zu stechen. Untersuchen Sie die Platte sorgfältig und stellen Sie sicher, dass alle Flecken ausgegeben wurden. Wenn nicht, fügen Sie manuell 2 μl an die entsprechende Position hinzu. Vergewissern Sie sich, dass die flüssigen Flecken schnell in den Agar einziehen und nicht zusammenlaufen.
      2. Wenn die Flecken zusammenlaufen, trocknen Sie einen neuen Satz frischer Agarplatten für einen längeren Zeitraum und wiederholen Sie die Fleckenbildung. Wenn es mehrere Plattentypen gibt (z. B. unterschiedliche Medien oder mit Antibiotika), sollten Sie diese ebenfalls erkennen. Geben Sie die restliche Lösung zurück in die Verdünnungsplatte und fahren Sie mit der nächsthöheren Konzentration fort.
         HINWEIS: Wenn Sie Verdünnungen erkennen, mischen Sie die nächste Verdünnung fünfmal, um sicherzustellen, dass der Inhalt der Pipettenspitzen von der vorherigen Verdünnung befreit wird. Die Verdünnungsplatten können >8 h bei 4 °C gelagert werden, ohne die Koloniezahlen zu beeinflussen.
6. Wiederholen Sie den Beschichtungsvorgang, wie in Schritt 2.5 beschrieben, für die verbleibenden Verdünnungsplatten, und gehen Sie von der am stärksten verdünnten zur am stärksten konzentrierten Platte über, bis die Platte mit dem ursprünglichen Homogenat erreicht ist.
7. Wenn die gesamte Flüssigkeit in den Agar aufgenommen wurde, drehen Sie die Platten um und legen Sie sie in den Inkubator (Abbildung 1A-10). Für Lactiplantibacillus und Acetobacter aus Drosophila beträgt die optimale Temperatur 30 °C auf MRS-Medien. Inkubieren, bis die Völker die optimale Größe erreicht haben: Die Völker sind groß genug, um sie deutlich zu sehen, aber nicht so groß, dass sie verschmelzen oder sich gegenseitig im Wachstum stören (siehe die repräsentativen Ergebnisse zur Quantifizierung der optimalen Größe).
   HINWEIS: Optimale Wachstumsbedingungen sind stammabhängig und müssen empirisch ermittelt werden. Für Lactiplantibacillus aus Drosophila beträgt die optimale Inkubationszeit 26 bis 30 Stunden auf MRS-Agar. Für Acetobacter aus Drosophila beträgt die optimale Inkubationszeit auf MRS je nach Stamm 30 h bis 48 h.
8. Nach der Inkubation sind die Platten bei Bedarf bei 4 °C zu lagern, bis sie zur Zählung bereit sind.

3. Quantifizierung der koloniebildenden Einheiten (KBE)

1. Quantifizieren Sie KBEs, indem Sie die Platten fotografieren und dann die Kolonien mit automatisierter Software zählen, wie unten beschrieben. Wenn die Platten bei 4 °C gelagert wurden, lassen Sie sie zuerst Raumtemperatur erreichen, damit sich kein Kondenswasser auf den Platten bildet, das zu Blendung führt.
2. Ordnen Sie die Platten in einer logischen Reihenfolge an und halten Sie sie während des Fotografierens in dieser Reihenfolge – das erleichtert die Benennung der Dateien. Richten Sie alle Platten so aus, dass sich A1 für alle Platten in der oberen linken Ecke befindet. Es wird empfohlen, die Ecke A1 mit einer eindeutigen ID zu beschriften, um eine Verwechslung der Fotos zu vermeiden. Stapeln Sie jede Verdünnungsreihe in der richtigen Reihenfolge.
3. Nehmen Sie den Tellerdeckel ab und stellen Sie die Platte mit A1 in der richtigen Ecke auf den Tisch. Die Platten-Fotobox ist für das Fotografieren dieser Tablettplatten optimiert und verfügt über Beleuchtungs- und Filteroptionen, um fluoreszierende Kolonien abzubilden.
4. Stellen Sie sich die Platten vor. Verwenden Sie die Kamera (siehe Materialtabelle) mit manuellen Einstellungen, um eine gleichmäßige Belichtung zwischen den Platten zu erzielen. Eine lange Brennweite wird empfohlen, um perspektivische Verzerrungen zu minimieren. Nehmen Sie das Foto mit einem Fernauslöser auf, um Unschärfen durch Verwacklungen zu minimieren.
5. Übertragen Sie die Bilder auf einen Computer und benennen Sie sie um, einschließlich des Namens des Experiments, des Medientyps, des Verdünnungsfaktors und aller anderen relevanten Details. Einige Betriebssysteme (siehe Materialtabelle) verfügen über eine nützliche Funktion zum Umbenennen von Stapeln im Finder, indem Sie mit der rechten Maustaste auf eine Auswahl von Dateien klicken.

4. Automatisierte Koloniezählung mit der Count-On-It-Suite

1. Schneiden Sie die Bilder mit dem mitgelieferten Croptacular-Plugin für ImageJ zu. Dieses Plugin hilft dabei, das Bild in ein geordnetes Array von Unterbereichen zu unterteilen (z. B. 8 x 12 für eine 96-Well-Platte). Die Teilregionen werden einzeln gezählt.
   1. Organisieren Sie die Bilder, die für die Quantifizierung verarbeitet werden sollen, in einem Ordner. Wählen Sie Dateinamen aus, die die Platten unterscheiden, da diese Dateinamen zu Spaltentiteln für jeden Satz von Zählungen werden. Erstellen Sie in diesem Ordner Unterordner mit den Namen "cropped" und "receipts".
   2. Starten Sie Croptacular und klicken Sie auf OK , um mit dem Zuschneiden zu beginnen.
      HINWEIS: Die Standardeinstellungen werden angezeigt und sind in der Regel ausreichend. Abhängig von der Auflösung des Bildes, der Beleuchtung, der Spotgröße usw. kann es hilfreich sein, die Basisparameter anzupassen.
   3. Wenn das Bild bereits gerade ist, drücken Sie einfach die Leertaste. Andernfalls begradigen Sie das Bild, indem Sie eine Linie entlang einer Kante zeichnen, die horizontal werden soll. Zeichnen Sie die Linie so oft wie nötig neu, wenn das Bild immer noch nicht begradigt erscheint.
   4. Zeichnen Sie als Nächstes einen Begrenzungsrahmen des Bereichs, für den gezählt werden soll. Passen Sie die Größe und Proportionen an, bis sich alle Flecken in ihren Zellen befinden. Ziehen Sie den Cursor außerhalb des Begrenzungsfelds, um das Raster zu aktualisieren. Wenn das Raster gut aussieht, drücken Sie die Leertaste.
   5. Stellen Sie sicher, dass sich das nächste Bild automatisch um den gleichen Winkel wie das erste dreht. Das Plugin geht davon aus, dass alle Fotos gleich ausgerichtet sind. Wenn dies zutrifft, drücken Sie die Leertaste , um fortzufahren. Andernfalls richten Sie das Bild wie zuvor aus. Das Raster erinnert sich auch an die gleiche Position wie im vorherigen Bild. Passen Sie bei Bedarf an, und drücken Sie dann die Leertaste.
2. Zählen Sie die Kolonien auf den Platten mit dem bereitgestellten Count-On-It: Gridiron-Plug-In für ImageJ auf.
   1. Starten Sie Count-On-It > Gridiron. Verwenden Sie die gleichen Rastereinstellungen wie bei Croptacular. Benutzer können einen ganzen Ordner stapeln, ein einzelnes Bild analysieren oder mit dem aktuellen Bild beginnen.
   2. Legen Sie den Schwellenwert basierend auf einem oberen und einem unteren Pixelintensitätswert fest. Setzen Sie den Schwellenwert so streng wie möglich, während Sie dennoch alle Völker auswählen. Im Idealfall ist zwischen den ausgewählten Kolonien etwas Platz, aber die Software ist in der Lage, die Blobs bis zu einem gewissen Grad zu segmentieren. Klicken Sie im Dialogfeld "Aktion erforderlich" auf OK , wenn der Schwellenwert zufriedenstellend ist.
   3. Um die Ergebnisse zu überprüfen, zoomen Sie heran und schauen Sie sich die Koloniezahlen genauer an. Wenn Sie auf Abbrechen klicken, wird das Plugin abgebrochen. Klicken Sie auf OK , um fortzufahren.
   4. Stellen Sie sicher, dass auf dem ersten Bild die Option zum Fortfahren oder Zurückkehren zum Setup-Menü angegeben ist, z. B. zum Ändern der minimalen Koloniegröße. Um mit dem Batch-Vorgang fortzufahren, klicken Sie auf OK. Wählen Sie dann einen Ordner aus, in dem die Beleg- und Ergebnistabelle aufbewahrt werden soll. Verwenden Sie den Ordner "Belege" oder erstellen Sie einen neuen Ordner.
   5. Nach dem ersten Bild wird für die nächsten Bilder standardmäßig der gleiche Schwellenwert wie in den vorherigen Einstellungen verwendet. Klicken Sie auf OK , um diese Einstellungen zu verwenden oder die Einstellungen anzupassen. Wenn die Fotos übereinstimmen und die Einstellung korrekt ist, klicken Sie im Dialogfeld "Aktion erforderlich" auf OK .
      HINWEIS: Sobald alle Bilder im Stapel fertiggestellt sind, wird die Ergebnistabelle automatisch im selben Ordner wie die Belege gespeichert.
   6. Überprüfen Sie die Zählbelege, die von der Software erstellt werden, und korrigieren Sie Zählfehler manuell. Das ImageJ-Plug-In ist statistisch korrekt, es treten jedoch Fehler auf. Prüfen Sie die Belege, um Ausreißer zu untersuchen und Fehlzählungen zu identifizieren. Die Software speichert die KBE-Daten als .csv Datei im selben Ordner wie die Belege.
3. Analysieren Sie die Daten mit der vom Benutzer bevorzugten Software.

Ergebnisse

Abbildung 1: Der Besiedlungsassay misst KBE in Hunderten von einzelnen Fliegen mit einem 96-Well-Plattenformat. (A) Bildlicher Überblick über den Kolonisationsassay und die Hochdurchsatz-Quantifizierungsmethode, die wie im Pro...

Materialien