Behandlung von Bakterien mit Ausscheidungen aus Pflanzenwurzeln zur Emulation von In-vitro-Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroben

Zusammenfassung

Quelle: Yi, Y., et al. Pflanze-Mikroben-Interaktion: Transkriptionelle Reaktion von Bacillus mycoides auf Kartoffelwurzelexsudate. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Vorbereitung und Behandlung von Bacillus mycoides-Kulturen zur Untersuchung von Pflanzen-Mikroben-Interaktionen. Er beschreibt die Schritte vom Streifen einer Stammkultur und deren Inkubation in flüssigem Medium bis hin zur Exposition der Bakterien gegenüber Pflanzenwurzelausscheidungen unter Rühren. Der Prozess gipfelt in der Ernte und dem Schockfrosten der Bakterienzellen für die anschließende Analyse der durch die Exsudate induzierten Genexpressionsänderungen.

Protokoll

1. Wachsende Bakterien

1. Streichen Sie einen B. mycoides-Stamm aus einem -80 °C Glycerinstamm auf eine Luria-Bertani (LB)-Agarplatte und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 30 °C.

2. Beimpfen Sie ein flüssiges LB-Medium mit einer einzelnen Kolonie von der Platte und züchten Sie die Kultur in einem Schüttelinkubator bei 200 U/min über Nacht bei
30 °C.

2. Behandlung und Probenahme von Bakterien

1. Um die Wachstumskurve der mit Wurzelexsudaten behandelten Bakterien mit einer Negativkontrolle zu vergleichen, wird eine Reihe von Kolben mit 50 ml flüssigem LB-Medium hergestellt. Geben Sie 0,5 ml der Bakterienkultur über Nacht in alle Kolben und geben Sie entweder 0 %, 5 %, 10 % oder 15 % (v/v) Wurzelexsudat bzw. steriles deionisiertes Wasser in das Medium.

2. Verwenden Sie eine Kultur mit entionisiertem Wasser anstelle von Wurzelexsudat als Kontrolle. Messen Sie anschließend alle 1 h die optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀). Generieren Sie eine Wachstumskurve, indem Sie die Werte von OD₆₀₀ über der Zeit darstellen.

3. Verdünnen Sie eine B. mycoides-Kultur über Nacht mit 90 ml vorgewärmtem LB-Medium auf einen anfänglichen OD₆₀₀ von ~ 0,05 in einem 300-ml-Kolben. Geben Sie 10 ml Wurzelexsudat in die Kultur und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 30 °C.

4. Verwenden Sie als Kontrolle eine sterile 10-ml-Aufbereitung mit deionisiertem Wasser. Entnehmen Sie die Zellen aus der Kultur, indem Sie sie 2 Minuten lang bei 4 °C bei 9.000 x g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und frieren Sie das Pellet sofort in flüssigem Stickstoff ein, dann lagern Sie es bis zur Verwendung bei -80 °C.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Natriumhypochlorit	Sigma	CAS: 7681-52-9	10-15% aktives Chlor
Luria-Bertani (LB) Brühe
Brutkasten	New Brunswick Scientific	Innova 4000
Spektralphotometer	Thermo Fisher Scientific	Genesys 20
Flüssigstickstoff
Glasperlen	Sigma	Nr. G8893	0,5 μm
2,0 ml Tube mit Schraubverschluss			RNase frei
1,5 ml und 2,0 ml Eppendorf Tube			RNase frei
Zentrifuge	Eppendorf	5430