Metallbegrenzter bakterieller Wachstumsassay zur Untersuchung der Rolle von metallresponsiven Genen

Zusammenfassung

Quelle: Maurakis, S., et al. Metallbegrenztes Wachstum von Neisseria gonorrhoeae zur Charakterisierung von metallresponsiven Genen und Metallaufnahme aus Wirtsliganden. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video zeigt einen metallbegrenzten Bakterienwachstumsassay, um die Rolle von metallresponsiven Genen zu untersuchen. Wildtyp- und mutierte Bakterien, die in metallabgereichertem Medium gezüchtet werden, werden mit Metallliganden inkubiert und ihr Wachstum wird mit einem Plattenleser überwacht. Unter metallarmen Bedingungen exprimieren die Wildtyp-Bakterien einen Oberflächenrezeptor, der die Aufnahme und das Wachstum von Metallen ermöglicht, während der Mutante dieser Rezeptor fehlt, was zu einem eingeschränkten Wachstum führt.

Protokoll

1. Herstellung von mit Chelex behandelten CDM-Stammlösungen (Defined Medium (CDM)

1. Stammlösung I
   1. Kombinieren Sie Natriumchlorid oder NaCl (233,8 g), Kaliumsulfat oder K₂SO₄ (40,0 g), Ammoniumchlorid oder NH₄Cl (8,8 g), Dikaliumhydrogenphosphat oder K₂HPO₄ (13,9 g) und Monokaliumdihydrogenphosphat oder KH₂PO₄ (10,9 g) in entionisiertem Wasser bis zu einem Endvolumen von 1 l.
   2. Sterilisieren Sie die Lösung und aliquotieren Sie sie in konische 50-ml-Röhrchen.
   3. Bei -20 °C lagern.
2. Stammlösung II
   1. Kombinieren Sie Thiaminsalzsäure oder HCl (0,2 g), Thiaminpyrophosphat-Cl (0,05 g), Calciumpantothenat (0,19 g) und Biotin (0,3 g) in 50 % (vol/vol) Ethanol bis zu einem Endvolumen von 1 l.
   2. In konische 50-ml-Röhrchen aliquotieren und bei -20 °C lagern.
3. Stammlösung III
   1. Kombinieren Sie L-Aspartat (4,0 g), L-Glutamat (10,4 g), L-Arginin (1,2 g), Glycin (0,2 g), L-Serin (0,4 g), L-Leucin (0,72 g), L-Isoleucin (0,24 g), L-Valin (0,48 g), L-Tyrosin (0,56 g), L-Prolin (0,4 g), L-Tryptophan (0,64 g), L-Threonin (0,4 g), L-Phenylalanin (0,2 g), L-Asparagin-H₂O (0,2 g), L-Glutamin (0,4 g), L-Histidin-HCl (0,2 g), L-Methionin (0,12 g), L-Alanin (0,8 g), L-Lysin (0,4 g) und reduziertes Glutathion (0,36 g) in 500 mL deionisiertem Wasser.
   2. L-Cystein (0,44 g) und L-Cystin (0,28 g) in einem minimalen Volumen (~1 ml) von 1 M HCl auflösen und zur obigen Aminosäurelösung hinzufügen.
   3. Den pH-Wert der Lösung mit 10 N Natriumhydroxid (NaOH) einstellen, bis alle Partikel aufgelöst sind. Der endgültige pH-Wert liegt bei 10,0–11,0.
   4. Bringen Sie das Endvolumen mit entionisiertem Wasser auf 1 l.
   5. Sterilisieren Sie die Lösung und aliquotieren Sie sie in ein Volumen von 250 ml.
   6. Bei -20 °C lagern.
4. Stammlösung IV
   1. Glukose (200 g) in entionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 l auflösen.
      HINWEIS: Die Lösung muss möglicherweise erhitzt werden, um die Glukose aufzulösen.
   2. Filtrieren Sie die Lösung und aliquotieren Sie sie in konische 50-ml-Röhrchen.
   3. Bei -20 °C lagern.
5. Stammlösung V
   1. Kombinieren Sie Hypoxanthin (5,0 g), Uracil (5,0 g) und NaOH (4,0 g) in entionisiertem Wasser bis zu einem Endvolumen von 1 l.
   2. Filter, sterilisieren und aliquotieren Sie in konische 50-ml-Röhrchen.
   3. Bei -20 °C lagern.
6. Lösung VI
   1. Bereiten Sie eine 1 M Calciumchlorid-Dihydrat oder CaCl 2-2H ₂O (147 g/L) Lösung in entionisiertem Wasser vor. Filtrieren, sterilisieren und bei Raumtemperatur (RT) lagern.
7. Stammlösung VII
   1. Bereiten Sie eine 1 M wasserfreie Magnesiumsulfatlösung (MgSO₄) in entionisiertem Wasser vor. Filter, sterilisieren und bei RT lagern.
8. Stammlösung VIII
   1. Bereiten Sie eine 1 M Natriumbicarbonatlösung (NaHCO₃) in entionisiertem Wasser vor. Filter, sterilisieren und bei RT lagern.

2. Zubereitung von 4x Sterile Konzentrat und 1x CDM

HINWEIS: Dieses Verfahren ist entweder in säurebehandelten sterilen Glaswaren oder Kunststoff durchzuführen, um ein Auslaugen von Metallen in die Lösungen zu verhindern.

1. Kombinieren Sie die Stammlösungen I (50 mL), II (20 mL), III (250 mL), IV (50 mL) und V (20 mL) mit 20,0 g 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES) und rühren Sie um, um sie zu mischen.
2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein und bringen Sie dann das endgültige Volumen mit entionisiertem Wasser auf 500 ml.
3. Waschen Sie das Chelex-100-Harz in 1 l entionisiertem Wasser, um Konservierungsstoffe zu entfernen, bevor Sie es dem 4x sterilen Konzentrat hinzufügen. Geben Sie dazu 50 g Harz in 1 l entionisiertes Wasser und rühren Sie mindestens 1 Stunde lang. Entfernen Sie das Wasser durch Vakuumfiltration und verwenden Sie dieses gewaschene Harz für Schritt 2.4.
4. 50 g Harz dazugeben und genau 90 min langsam rühren.
5. Entfernen Sie das Harz durch eine Filtersterilisation und lagern Sie das 4x sterile Konzentrat bei 4 °C.
6. Um eine 1-fache Arbeitskonzentration von CDM herzustellen, verdünnen Sie zuerst das 4-fache Konzentrat mit sterilem deionisiertem Wasser und fügen Sie dann Lösung VI (125 μl pro 500 mL 1x Lösung), Lösung VII (535 μl pro 500 mL) und Lösung VIII (10 mL pro 500 mL) hinzu.
   HINWEIS: Obwohl alle Stammlösungen bereits sterilisiert wurden, wird empfohlen, die 1x-Lösung nach der Zubereitung erneut zu filtrieren.

3. Vorbereitung der CDM-Platten

HINWEIS: Das folgende Rezept ergibt 1 l Medien für Teller, aber es ist am besten, diese in kleineren Mengen zuzubereiten. Alles skaliert proportional nach unten.

1. Gewaschene Agarose
   1. 50 g Agarose in 1 l entionisiertem Wasser auflösen und 1 h lang umrühren.
   2. Die Lösung in eine Zentrifugenflasche umfüllen und bei 1.200 x g für 15 min bei RT zentrifugieren. Den Überstand vorsichtig abgießen und wegwerfen.
   3. Fügen Sie ausreichend entionisiertes Wasser hinzu, um das Agarose-Pellet zu resuspendieren, und geben Sie es dann in einen 1-Liter-Kolben. Mit entionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 l bringen, dann umrühren und zentrifugieren wie in Schritt 3.1.2 beschrieben. Entsorgen Sie den Überstand.
   4. Fügen Sie ausreichend 100 % Ethanol hinzu, um das Pellet zu resuspendieren, und füllen Sie es dann in einen neuen 1-Liter-Kolben um. Mit Ethanol auf ein Endvolumen von 1 l bringen. Wie in Schritt 3.1.2 umrühren und zentrifugieren.
   5. Wiederholen Sie Schritt 3.1.4.
   6. Fügen Sie dem Agarose-Pellet Methanol hinzu, um es wieder zu resuspendieren, und geben Sie es dann in einen 1-Liter-Kolben. Mit Methanol auf ein Endvolumen von 1 l bringen. Wie in Schritt 3.1.2 umrühren und zentrifugieren.
   7. Wiederholen Sie Schritt 3.1.6.
   8. Gewaschene Agarose auf ein mit Alufolie ausgelegtes Tablett geben und in einem Abzug trocknen lassen. Nach dem Trocknen zur Langzeitlagerung in einen metallfreien Behälter umfüllen.
2. 10 g gewaschene Agarose und 5 g Kartoffelstärke in 750 ml entionisiertes Wasser geben.
3. 30 min lang bei 121 °C und 100 kPa über Atmosphärendruck autoklavieren.
4. Lassen Sie das Medium auf ~65 °C abkühlen und fügen Sie dann 250 mL 4X CDM, 250 μl Lösung VI, 1,07 mL Lösung VII und 20 mL Lösung VIII hinzu.
5. Falls gewünscht, fügen Sie die Metalle Ihrer Wahl hinzu, bevor Sie die Platten gießen. Die Zugabe von Chelatoren ist nicht notwendig, um metallfreie Bedingungen aufrechtzuerhalten.
6. In Petrischalen füllen und fest werden lassen.

4. Metallbegrenztes Wachstum von Neisseria gonorrhoeae

HINWEIS: Für die meisten Anwendungen ist es nicht notwendig, die Bakterien vor der Inokulation mit CDM zu metallisieren. Der anfängliche Verdopplungsschritt in CDM und die anschließende Verdünnung reichen aus, um die Gonokokken ihrer internen Eisen- und Zinkspeicher zu erschöpfen. Daher werden die ersten beiden Schritte des folgenden Verfahrens mit Agarplatten aus Gonococcus (GC)-Mediumbase durchgeführt, die mit Kellogg's Supplement I und 12,5 μM Eisennitrat (Fe(NO₃)₃) ergänzt wurden. Wenn eine frühe Metallbelastung gewünscht ist, empfehlen wir die Herstellung von GC-Medium-Basisplatten ohne Fe(NO₃)₃ und mit 5 μM TPEN (N,N,N',N'-Tetrakis (2-pyridylmethyl)ethylendiamin) für die Zinkchelatbildung oder 10 μM Deferoxamin für die Eisenchelatbildung. Die gesamte Inkubation erfolgt bei 37 °C mit 5 % CO₂.

1. Zwei Tage vor dem Experiment, an Tag -2, werden Gonokokken aus Tiefkühlbeständen auf GC-Mediumplatten gestreift und nicht länger als 24 Stunden inkubiert.
2. An Tag -1 werden einzelne Völker auf frische GC-Medium-Platten gestreift. Versuchen Sie, dies 14–16 Stunden vor dem Wachstumsexperiment zu tun.
3. Am Tag des Experiments werden 5–10 mL 1x CDM in einen säuregewaschenen 125 mL Sidearm-Kolben gegeben und mit diesem ein Klett-Kolorimeter ausgeblendet.
4. Verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen mit Wattespitze, um CDM aus gesunden, einzelnen Völkern zu impfen. Streben Sie 20 Klett-Einheiten an.
   HINWEIS: Wenn kein Klett-Kolorimeter zur Verfügung steht, ist auch ein Spektralphotometer geeignet. Es gibt keine allgemeingültige Umrechnungsformel für Klett-Einheiten in Außendurchmesser, aber es gibt einen groben Leitfaden (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
5. Unter Schütteln bei 250 U/min bis zu einer Massenverdopplung (40 Klett-Einheiten) inkubieren. Dies sollte zwischen 1-2 Stunden dauern.
6. Zu diesem Zeitpunkt werden die Kulturen durch Zugabe eines ausreichenden Volumens an CDM wieder verdünnt, um die Hälfte der ursprünglichen Kulturdichte zu erreichen (z. B. wenn 5 ml Kultur von 20 auf 40 Klett-Einheiten gestiegen sind, werden sie mit 15 ml CDM wieder auf 10 Klett-Einheiten reduziert), und das Wachstum wird wie in Schritt 4.5 fortgesetzt. Die spezifische Menge an Rückverdünnung, Metallbehandlungen usw. hängt von den nachgelagerten Anwendungen ab. Im Folgenden geben wir drei Beispiele

5. Metallbegrenzte Wachstumsassays

HINWEIS: Diese Assays beschreiben vorgefertigte Wachstumsvormischungen. Die Herstellung dieser Mischungen ist in Abschnitt 6 beschrieben.

1. Während der Massenverdopplung in Schritt 4.5 werden die Vertiefungen einer 96-Well-Mikroplatte mit 10x Vormischungen vorbehandelt. Legen Sie außerdem drei Vertiefungen fest, die als Leerproben dienen sollen. Geben Sie in diese Vertiefungen 10 μl 10x Premix und 90 μl CDM.
2. Sobald sich die Kulturen in den Seitenarmkolben verdoppelt haben, geben Sie 100 μl jeder Kultur in eine unbenutzte Vertiefung in der Mikroplatte und messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600). Dies kann mit Küvetten in einem Spektralphotometer erfolgen, aber bei einer größeren Anzahl von Stämmen innerhalb eines Assays kann dies umständlich werden und wird im Allgemeinen nicht empfohlen, es sei denn, Ihr Spektralphotometer kann direkt vom Arm des Seitenarmkolbens messen.
   1. Legen Sie die Kolben während der Messung des Außendurchmessers wieder in den Inkubator, um sicherzustellen, dass die Gonokokken lebensfähig bleiben.
3. Berechnen Sie die korrekte Verdünnungsmenge, die erforderlich ist, um die Kulturen auf OD600 = 0,02 zu bringen. Die 10x Vormischungen haben einen vernachlässigbaren Einfluss auf den OD und können bei der Berechnung weggelassen werden.
4. Verdünnen Sie die Kulturen mit CDM in kleinen Kulturröhrchen und fügen Sie ausreichend Volumen hinzu, um die 10x Vormischungen auf 1x in der Platte zu verdünnen. Wenn ein Tellerwärmer zur Verfügung steht, halten Sie die Platte während der Arbeit bei 37 °C.
5. Inkubieren Sie die Platte 8–12 Stunden lang durch Schütteln in einem Plattenlesegerät und messen Sie OD600 in den gewünschten Intervallen.

6. Metallbeladung von Transferrin, S100A7 und Calprotectin und Herstellung von 10x Vormischungen

HINWEIS: Verwenden Sie wie bei der CDM-Zubereitung säuregewaschenes Glas oder Kunststoff für die Lösungsvorbereitung.

1. Humanes Transferrin bei 10 mg/ml (125 μM) im Anfangspuffer (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO₃, pH = 8,4) lösen. S100A7 und Calprotectin sind in einem Puffer suspendiert, der aus 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM Calciumchlorid oder CaCl₂ besteht, pH = 8,0).
   1. Geben Sie Ferrationslösung (100 mM Natriumcitrat, 100 mM NaHCO₃, 5 mM Eisen(III)-chloridhexahydrat oder FeCl 3-6H₂O, pH = 8,4) zur Transferrinlösung, um eine Eisensättigung von 30 % zu erreichen (z. B. sind 75 μl Ferrationslösung für 5 mL Transferrin geeignet, wenn sie bei 10 mg/ml hergestellt werden).
   2. Fügen Sie Zinksulfat (ZnSO₄) zu S100A7 oder Calprotectin in einem molaren Verhältnis von 50 % zum Protein hinzu, um eine Sättigung von 25 % zu erreichen (jedes Proteinmolekül hat zwei Metallbindungsstellen). Es können Präparate aus 100 μM S100A7 oder Calprotectin mit 50 μM ZnSO₄ verwendet werden.
   3. In beiden Fällen ist das Mischen für die Metallbeladung mindestens 1 h lang zu ermöglichen.
2. Bereiten Sie 4 l Dialysepuffer vor (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO₃, pH = 7,4). Teilen Sie es in zwei separate 2-Liter-Volumina auf und stellen Sie eines auf 4 °C.
3. Geben Sie die metallbeladenen Proteine mit einer Spritze in eine Dialysekassette und dialysieren Sie 4 h lang bei RT gegen das erste Puffervolumen.
4. Stellen Sie die Kassette auf das zweite Puffervolumen und dialysieren Sie sie über Nacht bei 4 °C. Nach diesen Schritten sollten alle ungebundenen Metalle entfernt werden.
   HINWEIS: Wir empfehlen einen Bicinchoninsäure-Assay, um die Proteinkonzentrationen nach der Dialyse zu bestimmen.
5. Verwenden Sie eine 10-fache Transferrin-Vormischung für die Verwendung von Transferrin als einzige Eisenquelle.
   1. Bereiten Sie diese Vormischung vor, indem Sie 30 % humanes Fe-Transferrin und bovines Apo-Transferrin (hergestellt bei 125 μM, wie für humanes Transferrin beschrieben, ohne den Eisenladeschritt) auf 75 μM bzw. 30 μM in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnen. Eine Positivkontroll-Vormischung ersetzt 30 % Fe-Transferrin durch 75 μM Fe(NO)₃, und eine Negativkontroll-Vormischung lässt jegliches zugesetzte Eisen aus, so dass nur das Rinder-Apo-Transferrin übrig bleibt. Im Wachstumsassay verdünnen Sie 10 μl dieser Konzentrate mit 90 μl Kultur. Die Endkonzentrationen betragen 7,5 μM, 30 % humanes Fe-Transferrin und 3 μM bovines Apo-Transferrin.
6. Verwenden Sie eine modifizierte Version der Transferrin 10x-Vormischung für die Verwendung von S100A7 oder Calprotectin als alleinige Zinkquelle.
   1. Für eine Positivkontroll-Vormischung werden 50 μM ZnSO₄ in die Transferrin-Vormischung eingebaut. Für eine Negativkontrolle 50 μM TPEN einarbeiten und das Zink weglassen. Nehmen Sie dann 10 μl von jedem dieser Proben für jede benötigte Probe und geben Sie dieses Volumen in ein neues Röhrchen. Fügen Sie dazu halb so viel steriles PBS hinzu. Wenn z. B. 10 Vertiefungen die Positivkontroll-Vormischung erhalten, nehmen Sie 100 μl Vormischung, geben Sie sie in ein neues Röhrchen und fügen Sie 50 μl PBS hinzu. Machen Sie dasselbe für die Negativkontrolle.
   2. Um die S100A7- oder Calprotectin-Vormischung herzustellen, nehmen Sie 10 μl der Negativkontroll-Vormischung pro benötigter Vertiefung, geben Sie sie in ein neues Röhrchen und fügen Sie die Hälfte des Volumens von 25 % Zn-S100A7 oder Calprotectin hinzu. Im Wachstumsassay 15 μl Premix verwenden und mit 85 μl Kultur verdünnen. Die Endkonzentrationen für die Transferrine bleiben die gleichen wie in Schritt 8.5, mit einer Zugabe von 5 μM Zn, TPEN oder S100A7/Calprotectin.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
125 mL Seitenarmkolben	Bellco	Artikel-Nr.: 2578-S0030	Muss individuell bestellt werden
2-Mercaptoethanol	VWR	M131	Offen im Abzug
3MM Papier	GE Gesundheit	3030-6461	Im Text "Filterpapier" genannt
Agarose	Biolone	BIO-41025	Pulver
Ammoniumchlorid	Sigma-Aldrich	Nr. A9434	Pulver
Transferrin für Rinder	Sigma-Aldrich	Nr. T1428	Pulver
Calciumchlorid-Dihydrat	Sigma-Aldrich	Nr. C5080	Pulver
Calciumpantothenat	Sigma-Aldrich	Nr. C8731	Pulver
Calprotectin	N/A	N/A	Diese werden uns von einem Mitarbeiter zur Verfügung gestellt
Chelex-100 Harz	Bio-Rad	142-2832	Vor Gebrauch mit entionisiertem Wasser waschen
Steriler Tupfer mit Wattespitze	Puritaner	25-806	Baumwolle ist für diese Anwendung besser als Polyester
Deferoxamin	Sigma-Aldrich	Nr. D9533	Pulver
D-Glukose	Sigma-Aldrich	Nr. G8270	Pulver
Dialyse-Kassette	Thermo	66380	Vor Gebrauch in Puffer einweichen
Ethanol	Koptec	Nr. V1016	Entzündbare Flüssigkeit, im Schrank für brennbare Stoffe aufbewahren
Eisenchlorid	Sigma-Aldrich	Nr. F7134	Reizend, nicht einatmen
Eisennitrat-Nonahydrat	Sigma-Aldrich	Nr. F1143	Reizend, nicht einatmen
GC mittlerer Belag	Difco	228950	Pulver, enthält bereits Agar
Glycin	Sigma-Aldrich	Nr. G8898	Pulver
HEPES	Fischer	Nr. L-15694	Pulver
Humanes Transferrin	Sigma-Aldrich	Nr. T2030	Pulver
Hypoxanthin	Sigma-Aldrich	Nr. H9377	Pulver
Klett Kolorimeter	Manostat	37012-0000	Verwendet Farbtransmission zur Beurteilung der Kulturdichte
L-Alanin	Sigma-Aldrich	Nr. A7627	Pulver
L-Arginin	Sigma-Aldrich	Nr. A5006	Pulver
L-Asparagin-Monohydrat	Sigma-Aldrich	Nr. A8381	Pulver
L-Aspartat	Sigma-Aldrich	Nr. A9256	Pulver
L-Cystein-Hydrochlorid	Sigma-Aldrich	Nr. C1276	Pulver
L-Cystin	Sigma-Aldrich	Nr. C8755	Pulver
L-Glutamat	Sigma-Aldrich	Nr. G1251	Pulver
L-Glutamin	Sigma-Aldrich	Nr. G3126	Pulver
L-Histidin-Monohydrochlorid	Sigma-Aldrich	Nr. H8125	Pulver
L-Isoleucin	Sigma-Aldrich	Nr. I2752	Pulver
L-Leucin	Sigma-Aldrich	Nr. L8000	Pulver
L-Lysin	Sigma-Aldrich	Nr. L5501	Pulver
L-Methionin	Sigma-Aldrich	Nr. M9625	Pulver
L-Phenylalanin	Sigma-Aldrich	Nr. P2126	Pulver
L-Prolin	Sigma-Aldrich	Nr. P0380	Pulver
L-Serin	Sigma-Aldrich	Nr. S4500	Pulver
L-Threonin	Sigma-Aldrich	Nr. T8625	Pulver
L-Tryptophan	Sigma-Aldrich	Nr. T0254	Pulver
L-Tyrosin	Sigma-Aldrich	Nr. T3754	Pulver
L-Valin	Sigma-Aldrich	Nr. V0500	Pulver
Magnesiumsulfat	Sigma-Aldrich	M7506	Pulver
Methanol	VWR	BDH1135-4LP	Entzündbare Flüssigkeit, im Schrank für brennbare Stoffe aufbewahren
Kaliumphosphat zweibasisch	Sigma-Aldrich	60356	Pulver
Kaliumphosphat einbasisch	Sigma-Aldrich	Nr. P9791	Pulver
Kaliumsulfat	Sigma-Aldrich	Nr. P0772	Pulver
Kartoffelstärke	Sigma-Aldrich	Nr. S4251	Pulver
Reduziertes Glutathion	Sigma-Aldrich	Nr. G4251	Vorsichtig damit umgehen. Kann leicht oxidieren.
Nr. S100A7	N/A	N/A	Diese werden uns von einem Mitarbeiter zur Verfügung gestellt
Natriumbicarbonat	Sigma-Aldrich	Nr. S5761	Pulver
Natriumchlorid	VWR	470302	Pulver
Natriumcitrat	Fischer	Nr. S279	Pulver
Natriumhydroxid	Acros Organics	383040010	Hochgradig hygroskopisch
Thiaminhydrochlorid	Sigma-Aldrich	Nr. T4625	Pulver
Thiaminpyrophosphat	Sigma-Aldrich	Nr. C8754	Auch Cocarboxylase genannt
TPEN	Sigma-Aldrich	Nr. P4413	Pulver
Tris	VWR	497	Pulver
Uracil	Sigma-Aldrich	Nr. 0750	Pulver
Zinksulf-Heptahydrat	Sigma-Aldrich	204986	Reizend, nicht einatmen