Detektion der Oberflächenmetalltransporter in Neisseria gonorrhoeae mittels Dot Blot

Zusammenfassung

Quelle: Maurakis, S. und Cornelissen, C. N. Metallbegrenztes Wachstum von Neisseria gonorrhoeae zur Charakterisierung von metallresponsiven Genen und Metallerwerb aus Wirtsliganden. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt das Verfahren zum Nachweis von Oberflächenmetalltransportern in Neisseria gonorrhoeaee , die unter metallbegrenzten Bedingungen gezüchtet wurden, unter Verwendung eines Dot-Blot-Assays, der Ligandenbindung, Antikörperdetektion und kolorimetrische Visualisierung umfasst.

Protokoll

1. Nachweis der Ligandenbindung durch Metalltransporter der Außenmembran

1. Verdünnen Sie die Kulturen mit drei Volumina CDM (chelex-treated defined medium).
2. Dann 4 h unter Schütteln inkubieren.
3. Kurz vor der 4-Stunden-Marke schneiden Sie drei Stücke Filterpapier und ein Stück Nitrozellulose auf die ungefähre Größe zu, die für ein Dot-Blot-Gerät erforderlich ist. Weichen Sie die Nitrozellulose in entionisiertem Wasser ein und montieren Sie dann das Gerät mit Filterpapier unter der Nitrozellulose.
4. Erfassen Sie nach 4 h die Zelldichten und standardisieren Sie auf eine geeignete Enddichte.
5. Pipettieren Sie Zellkulturen auf die Nitrozellulose und lassen Sie dem Filterpapier ausreichend Zeit, die gesamte Flüssigkeit aufzunehmen.
6. Zerlegen Sie das Gerät, lassen Sie den Blot trocknen und blockieren Sie die Nitrozellulosemembran für 1 h in 5%igem Rinderserumalbumin oder fettfreier Milch (w/v) in Tris-gepufferter Kochsalzlösung.
7. Bauen Sie das Dot-Blot-Gerät wieder zusammen und ersetzen Sie das Filterpapier durch Paraffinfolie, um eine auslaufsichere Abdichtung unter der Nitrozellulose zu schaffen.
8. Verdünnen Sie den interessierenden Metallbindungsliganden 1 h lang in Blocker- und Sondenzellen auf 0,2 μM.
9. Saugen Sie die Flüssigkeit mit einem Vakuum ab, waschen Sie den Blot und befolgen Sie dann die immunologischen Standardverfahren, um das Signal zu entwickeln. Die Waschschritte können in oder außerhalb des Geräts durchgeführt werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
125 mL Seitenarmkolben	Bellco	Artikel-Nr.: 2578-S0030	Muss individuell bestellt werden
2-Mercaptoethanol	VWR	M131	Offen im Abzug
3MM Papier	GE Gesundheit	3030-6461	Im Text "Filterpapier" genannt
Blocker für Blotting-Qualität	Bio-Rad	170-6404	Fettfreie Trockenmilch
Rinderserumalbumin	Roche	3116964001	Pulver
Calprotectin	N/A	N/A	Diese werden uns von einem Mitarbeiter zur Verfügung gestellt
Chelex-100 Harz	Bio-Rad	142-2832	Vor Gebrauch mit entionisiertem Wasser waschen
Steriler Tupfer mit Wattespitze	Puritaner	25-806	Baumwolle ist für diese Anwendung besser als Polyester
Dot-Blot-Gerät	Schleicher & Schwell	10484138	Verschließen Sie den Deckel vor dem Laden der Probe so fest wie möglich
Ethanol	Koptec	Nr. V1016	Entzündbare Flüssigkeit, im Schrank für brennbare Stoffe aufbewahren
Klett Kolorimeter	Manostat	37012-0000	Verwendet Farbtransmission zur Beurteilung der Kulturdichte
Methanol	VWR	BDH1135-4LP	Entzündbare Flüssigkeit, im Schrank für brennbare Stoffe aufbewahren
Nitrozellulose	GE Gesundheit	10600002	Bis zur Verwendung in der Schutzhülle aufbewahren
Nr. S100A7	N/A	N/A	Diese werden uns von einem Mitarbeiter zur Verfügung gestellt
Natriumchlorid	VWR	470302	Pulver
Tris	VWR	497	Pulver