Kultivierung von nicht typisierbaren Haemophilus influenzae

Zusammenfassung

Quelle: Venuprasad, K. et. al., Intratracheale Verabreichung von Haemophilus influenzae in Mausmodellen zur Untersuchung von Atemwegsentzündungen. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die Kultivierung von nicht-typisierbaren Haemophilus influenzae und die Vorbereitung eines dosisstandardisierten Inokulums für nachgeschaltete Kolonisations- oder Infektionsstudien.

Protokoll

1. Kultivierung von nicht typisierbarem Haemophilus influenzae (NTHi) und Vorbereitung des Inokulums

1. Teller NTHi auf eine Schokoladen-Agar-Platte und stelle die Platte kopfüber in einen befeuchteten CO₂ -Inkubator über Nacht bei 37 °C und 5% CO₂. Kulturieren Sie die Bakterien am nächsten Tag in der Gehirn-Herz-Infusionsbrühe. Geben Sie dann 1 ml der Brühe in eine sterile 1,5 ml Tube.
2. Zentrifugieren Sie bei 4.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
3. 100 μl der resuspendierten Lösung in 900 μl 1x PBS überführen und die Extinktion der verdünnten Kultur bei 600 nm Wellenlänge in einem Spektralphotometer messen.
4. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit und die koloniebildenden Einheiten (KBE) des Inokulums, indem Sie serielle Verdünnungen im Verhältnis 1:10 auf Schokoladenagarplatten kultivieren und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
5. Basierend auf der Lebensfähigkeit und den KBE, die im vorherigen Schritt bestimmt wurden, ist das Inokulum auf eine Endkonzentration von 20 x 10⁶ KBE/ml einzustellen.

Materialien