Messung der Fehltranslationsraten von Mycobacterium smegmatis mit einem GFP/Luciferase-Reportersystem

Zusammenfassung

Quelle: Chen, Y., et al., Messung spezifischer mykobakterieller Fehltranslationsraten mit Gain-of-Function-Reportersystemen. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt eine Methode zur Quantifizierung von Fehltranslationen in Mycobacterium smegmatis unter Verwendung eines induzierbaren GFP und eines sezernierten mutierten Luciferase-Reportersystems. Es zeigt, wie die Lumineszenz, die aus einer Fehltranslation resultiert, gemessen und mit der GFP-Fluoreszenz verglichen wird, um den Einfluss eines Testmoleküls auf die Translationsgenauigkeit zu bewerten.

Protokoll

1. Nanoluc-Luziferase (Nluc)/Grün fluoreszierendes Protein (GFP) Reporter

ANMERKUNG: Eine visuelle Darstellung dieser Methode finden Sie in Abbildung 1.

1. Der bakterielle Reporterstamm aus -80 °C Stamm wird mit 2 mL 7H9-Medium beimpft. Bei 37 °C 1 bis 2 Tage schütteln, bis OD₆₀₀ die stationäre Phase erreicht (OD >3).
2. Subkultur auf 50 mL 7H9-Medium und wachsen Sie, bis OD₆₀₀ die späte stationäre Phase (>4) erreicht.
3. Bevor Sie die Bakterien auf eine 96-Well-Platte aliquotieren, fügen Sie Anhydrotetracyclin (ATC) in einer Endkonzentration von 50 ng/ml hinzu und mischen Sie gut. Die Induktion der Bulk-Kultur stellt sicher, dass alle Wells die gleiche Menge an Induktor enthalten und dass die Induktion des Reporters synchronisiert ist. Aliquotieren Sie die Bakterien auf eine durchsichtige 96-Well-Platte mit rundem Boden und einem Volumen von 100 μl in jeder Well.
4. Um nach kleinen Molekülen zu suchen, die die Fehltranslationsraten beeinflussen, fügen Sie die Verbindung in der angegebenen Konzentration in ausgewählten Vertiefungen hinzu. Verwenden Sie für die Zwecke dieses Protokolls Kasugamycin (in den in Abbildung 2 angegebenen Dosen) zur Veranschaulichung. Fügen Sie verschiedene Dosen von Kasugamycin zu ausgewählten Vertiefungen hinzu (jede Versuchsgruppe sollte mindestens zwei biologische Replikate enthalten).
5. Die Proben schütteln und bei 37 °C 16-20 h induzieren.
   ANMERKUNG: Es ist notwendig, die Platte mit Folie zu versiegeln. Außerdem müssen alle Randvertiefungen mit mindestens 200 μl sterilem Wasser gefüllt werden, um die Verdunstung aus den Testvertiefungen zu begrenzen.
6. Entnehmen Sie 80 μl aus jeder Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette und übertragen Sie die Proben auf eine schwarze 96-Well-Platte (wodurch die Messung des Fluoreszenzsignals maximiert wird). Messen Sie das GFP-Signal per Luminometer mit 20 ms als Integrationszeit.
7. Nach der Messung des GFP-Signals zentrifugieren Sie die Platte bei 3.220 x g für 10 min. Übertragen Sie 50 μl des Überstands auf eine 96-Well-Platte mit weißem Boden (wodurch die Lumineszenzsignalmessung maximiert wird), geben Sie 50 μl Nluc-Substrat in jede Vertiefung, mischen Sie sie gut und messen Sie die Lumineszenz per Luminometer mit 1.000 ms als Integrationszeit.
8. Bestimmen Sie das Nluc/GFP-Verhältnis, indem Sie die korrigierten Nluc-Lumineszenzwerte durch die GFP-Fluoreszenz dividieren: Dieses Maß (in beliebigen Einheiten) ist ein relatives Maß für Aspartat für Asparagin-Fehltranslation.

Ergebnisse

Abbildung 1: Überblick über die Messung der Fehltranslationsrate Nluc-GFP Reporter. Eine frische Kultur von M. smegmatis, die mit den Nluc- und GFP-Reportern transformiert wurde, wird auf ein ausreichendes Volumen gezüchtet, damit alle P...

Materialien