Entnahme von bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit aus einem Mausmodell, das mit nicht typisierbarem Haemophilus influenzae infiziert war

Zusammenfassung

Quelle: Venuprasad, K., et al. Intratracheale Verabreichung von Haemophilus influenzae in Mausmodellen zur Untersuchung von Atemwegsentzündungen. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die Entnahme und Verarbeitung von bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit aus einer euthanasierten Maus, die mit nicht typisierbaren Haemophilus influenzae infiziert war, für die nachgelagerte Analyse.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Bronchoalveoläres Lavage-Fluid (BALF) Kollektion
   1. Opfern Sie die Maus 24 Stunden nach der Infektion durch Gebärmutterhalsluxation.
   2. Öffnen Sie die Bauchhöhle der Maus mit einer anatomischen Schere, schneiden Sie die ventrale Aorta auf, um zu bluten, und legen Sie den ventralen Teil der Lunge frei.
   3. Legen Sie die Luftröhre frei und intubieren Sie sie mit einem 20-Gauge-Katheter. 0,8 ml BALF-Puffer (1x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung), 0,1 % Dextrose, 10 U/ml Heparin) einträufeln und die Spülung durch sanfte Aspiration auffangen. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.
   4. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in 100 μl BALF-Suspension mit einem Hämozytometer unter 10-facher Vergrößerung und Trypanblau-Färbung.
   5. Bereiten Sie Objektträger für die modifizierte Giemsa-Färbung vor. Aliquotieren Sie 100 μl BALF in die entsprechenden Vertiefungen des Cytospins und zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min. Trocknen Sie die Objektträger 10 Minuten lang und färben Sie die Zellen mit modifiziertem Giemsa-Fleck gemäß den Protokollen des Herstellers.
   6. Die verbleibenden Zellen können für nachfolgende Analysen verwendet werden, wie z. B. fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), konfokale Mikroskopie, Genexpression und Western Blot.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dextrose wasserfrei	Themo Scientific	Nr. R01300
Heparin	Hospira, Inc	RL-3010
Spritzennadel 20/26G	BD	(REF305115/175)
1 ml Spritze	BD	REF-309602
Katheter 20GA	BD	REF 381433
Pinzette #5 Edelstahl, 11cm lang	kentwissenschaftlich	INS600095
5 ml Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden	BD	REF 352058
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Lichtlabore	A-7001-R
1X PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)	Gibco	10010-023
RBC-Lyse-Puffer (10-fach)	Biolegende	420301