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1. Synchrone Kultur von Cyanobakterien
- Kultur Synechococcus elongatus PCC 7942 auf einer sterilisierten blaugrünen Medium 11 (BG 11) Platte (in einer 9 cm sterilen Petrischale aus Kunststoff), die 1,5 % (w/v) Agar und 0,3 % (w/v) Natriumthiosulfat enthält.
- Die Platten werden in eine Wachstumskammer bei 23 °C mit einer Lichtintensität von 50 μE/m2/s gestellt und 12 h Licht-/12 h Dunkelzyklen ausgesetzt.
- Übertragen Sie die Zellen einmal pro Woche auf frische BG11-Agarplatten.
ANMERKUNG: Die Kulturen auf dem Agar erscheinen nach einer Woche unter diesen Kulturbedingungen als grüne Bänder aus aktiv proliferierenden Zellen. - Nehmen Sie grüne Zellklumpen mit einer flammsterilisierten Drahtschlaufe und streifen Sie die Zellen auf eine frische BG11-Agarplatte. Tun Sie dies auf einer sauberen Bank.
2. Überwachung durch Fluoreszenzmikroskopie
- Verwenden Sie Zellen, die 6 Tage lang auf der Agarplatte kultiviert wurden, um die DNA-Verdichtung zu beobachten. Entnehmen Sie am Ende der Lichtperiode Zellen von der Platte, indem Sie 1 ml 0,2 M Saccharoselösung über die Zellen gießen. Wiederholen Sie den Vorgang und gießen Sie die Lösung auf die Zellen, so dass die meisten Zellen gesammelt sind. Übertragen Sie die suspendierte Zelllösung zur DNA-Färbung in ein Mikroröhrchen.
- Geben Sie die DNA-Färbefarbstofflösung (z. B. Hoechst 33342) zu 500 μl der suspendierten Zelllösung in einem Mikroröhrchen bis zu einer Endkonzentration von 1 μg/ml. Halten Sie die Tube dann 10 Minuten lang im Dunkeln.
- Zentrifugieren Sie 1 min lang bei 2.000 x g , um die Zellen zu sedimentieren. Den Überstand verwerfen und 10 μl 0,2 M Saccharoselösung hinzufügen, um eine dichte Zellsuspension zu erhalten.
- Übertragen Sie 1 μl der Lösung, die die gefärbten Zellen enthält, auf ein Objektträgerglas, legen Sie ein Deckglas auf und beobachten Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem Ultraviolettfilter (UV) ausgestattet ist, unter Verwendung einer Objektivlinse mit einer 100-fachen Vergrößerung und Immersionsöl.
- Vergewissern Sie sich, dass die DNA-Verdichtung an dieser Stelle in den meisten Zellen beobachtet wird.