Synthese von Nanodisc-stabilisierten Membranprotein-Antigenen mit einem zellfreien System

Zusammenfassung

Quelle: Gilmore, S. F., et al. Zellfrei skalierte Produktion und adjuvante Addition an ein rekombinantes Hauptprotein der äußeren Membran aus Chlamydia muridarum für die Impfstoffentwicklung. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt die zellfreie Synthese von Nanodisc-stabilisierten Membranprotein-Antigenen unter Verwendung eines Dual-Kompartiment-Systems. Das Gerät bietet optimale Bedingungen für eine effiziente Proteinsynthese, eine ordnungsgemäße Faltung und eine stabile Integration in Nanodiscs.

Protokoll

Zellfreie Produktion von Major outer membrane Protein-Telodendrimer-Nanolipoprotein-Partikeln (MOMP-tNLPs) für Impfstoffformulierungen für Untereinheiten

1. Bereiten Sie MOMP-tNLPs mit zellfreien Methoden vor.
   1. Öffnen Sie zwei Stunden vor dem Einrichten der zellfreien Reaktion das prokaryotische zellfreie Proteinexpressionskit und tauen Sie einen der Rekonstitutionspuffer auf. Nach dem Auftauen eine Tablette Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-freien Proteasehemmer-Cocktail hinzufügen und vollständig auflösen lassen.

2. Befolgen Sie dieses Protokoll mit einem Kit, das für die Durchführung von 5 x 1 ml-Reaktionen ausgelegt ist.

   ANMERKUNG: Eine typische Scale-up-Produktion beträgt 3 x 1 ml.

   1. Für jede 1-ml-Reaktion 525 μl Rekonstitutionspuffer in die E. coli-Lysatflasche geben und vorsichtig rollen, um sich aufzulösen. Geben Sie 250 μl Rekonstitutionspuffer in die Flasche mit Reaktionsadditiven (z. B. Adenosintriphosphat, Guanosintriphosphat) und rollen Sie es vorsichtig auf, um es aufzulösen.
   2. Geben Sie 8,1 ml Rekonstitutionspuffer in die Reaktionsflasche, verschließen Sie sie mit einem Gummistopfen (achten Sie darauf, die Innenseite des Gummistopfens nicht zu berühren) und drehen Sie ihn vorsichtig um/rollen, um sich aufzulösen.
   3. Geben Sie 3 ml Rekonstitutionspuffer in die Flasche mit der Aminosäuremischung, verschließen Sie sie mit einem Gummistopfen und drehen Sie sie vorsichtig um/rollen, um sich aufzulösen.
      ANMERKUNG: Achten Sie darauf, die Innenseite des Gummistopfens nicht zu berühren, da dies zu Verunreinigungen führen kann.
   4. Geben Sie 1,8 ml Rekonstitutionspuffer in die Methioninflasche, rollen Sie es vorsichtig, um es aufzulösen, und lagern Sie es dann bis zur Verwendung auf Eis.
       
3. Bereiten Sie die Reaktionslösung vor.
   1. Geben Sie in die E. coli-Lysatflasche 225 μl rekonstituierten Reaktionsmix, 270 μl rekonstituierten Aminosäuremix ohne Methionin und 30 μl rekonstituiertes Methionin. Zusätzlich fügen Sie 400 μl des 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC)/Telodendrimer-Gemisches, 15 μg MOMP-Plasmid und 0,6 μg Δ49ApolipoproteinA1-Plasmid hinzu. Zum Mischen rollen/leicht schütteln.
      ANMERKUNG: Stellen Sie sicher, dass beide Plasmide aus demselben Plasmidrückgrat aufgebaut sind. Nicht wirbeln.
   2. Nehmen Sie 20 μl der Gesamtlösung und stellen Sie sie in einem 1,5-ml-Röhrchen für die grün fluoreszierendes Protein (GFP)-exprimierende Kontrollreaktion beiseite (siehe unten).
       
4. Bereiten Sie die Futterlösung vor. In die Futtermischflasche werden 2,65 ml rekonstituierte Aminosäuremischung ohne Methionin und 300 μl rekonstituiertes Methionin gegeben. Rollen/vorsichtig schütteln, um sich aufzulösen.
   ANMERKUNG: Zu diesem Zeitpunkt können der ungenutzte Rekonstitutionspuffer und das Methionin zur Lagerung in den Gefrierschrank zurückgestellt werden.
    
5. 1 ml der Reaktionslösung in die innere Reaktionskammer des zellfreien Reaktionskits überführen und nach Befüllung verschließen. 10 mL der Zuführlösung in die äußere Kammer des Reaktionsgefäßes geben und verschließen.
   ANMERKUNG: Überfüllen Sie die Kammern nicht! Das Vorhandensein von Luftblasen am oberen Rand sowohl der inneren Reaktionskammer als auch der inneren Zuführkammer wirkt sich nachteilig auf die Reaktion aus. Die verbleibende Reaktionslösung kann in ein 1,5-ml-Röhrchen gegeben und neben dem Hauptgefäß gemischt werden.
    
6. 0,5 μl des GFP-Kontrollplasmids (0,5 mg/ml) zu dem zuvor aliquotierten 20-μl-Reaktionsgemisch hinzufügen.
   ANMERKUNG: Viele Kits werden mit einem Kontrollplasmid für Qualitätskontrollzwecke geliefert. Die meisten GFP-exprimierenden Plasmide mit einem T7-Promotor und einer E.coli-Ribosomen-Bindungsstelle (RBS) können auch als Kontrollplasmid verwendet werden.
    
7. Die Reaktion in einen Schüttler bei 300 U/min und 30 °C für bis zu 18 h geben. Um zu überprüfen, ob die Reaktion erfolgreich war, verwenden Sie eine UV-Lichtquelle, um die Fluoreszenz aufgrund der Synthese des Kontroll-GFP (Abbildung 1) nach nur 15 Minuten Inkubation zu überprüfen.
   ANMERKUNG: Diese Bedingungen, insbesondere die Temperatur, müssen möglicherweise für die Expression anderer Membranproteine optimiert werden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Expression und Aufreinigung von MOMP-tNLP. (A) Bild von Röhrchen mit kleinen Aliquoten einer zellfreien Reaktion, die erfolgreich das Luminieren von GFP unter UV-Lichtquelle exprimierte (rechts) im Vergl...

Materialien