Präparation und Umwandlung von Bakterien mittels Hochspannungs-Elektroporation

Zusammenfassung

Quelle: Stefan, A., et al., Die vielfältigen Vorteile der Protein-Co-expression in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Transformation von Escherichia coli mit einem Plasmid, das ein Antibiotikaresistenzgen trägt, einschließlich Zellvorbereitung, Elektroporation, Wiederherstellung und Auswahl von Transformanten.

Protokoll

1. Isolierung von E. coli-Co-Transformanten

1. Bereiten Sie elektrokompetente Zellen des entsprechenden E. coli-Stammes vor, die transformiert werden sollen. Eine einzelne Kolonie des Stammes ihrer Wahl wird in 1 ml Luria-Bertani (LB)-Medium (Trypton, Hefeextrakt, NaCl in 10, 5 bzw. 10 g/l) überführt und bei 37 °C unter Schüttelbedingungen von 180 U/min inkubiert. Die Vorkultur wird 1:500 in 25 ml frischem LB-Medium verdünnt und die Kultur bei 37 °C inkubiert.
2. In der logaritären Phase (0,6 O.D. oder optische Dichte) zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 5.000 x g für 20 min und resuspendieren Sie das Pellet in 10 % v/v eiskaltem, sterilem Glycerin-Wasser in der Hälfte des ursprünglichen Kulturvolumens. Wiederholen Sie diesen Schritt 4 Mal und halbieren Sie das Resuspensionsvolumen. Zum Schluss resuspendieren Sie das Pellet in Glycerin/Wasser und teilen die Zellsuspension in 50 μl Aliquote. Lagern Sie die Aliquots bei -80 °C bis zu 6 Monate.
3. Das gewünschte Plasmid wird in sterilem Wasser gelöst, das mit 0,5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) versetzt ist. Tauen Sie ein Aliquot der elektrokompetenten Zellen auf Eis auf und mischen Sie es mit einer geeigneten Menge (2,5-5 ng) des Vektors. Geben Sie das Gemisch in eine 0,1 cm Küvette, die für die Elektroporation geeignet ist, und geben Sie 1,8 kV.
4. Übertragen Sie die elektroporierten Zellen sofort in 1 ml SOC-Medium (superoptimale Bouillon mit Katabolit-Repression) (LB-Medium, ergänzt mit 0,2 % w/v Glukose, 10 mM MgCl₂, 2,5 mM KCl), inkubieren Sie 1 Stunde lang unter Schütteln und übertragen Sie schließlich 100 μl Aliquote mit dem entsprechenden Antibiotikum in Petrischale, die LB-Agar enthalten. O/N bei 37 °C inkubieren.
5. Reinigen Sie die Transformanten, indem Sie einzelne Kolonien auf Petrischalen streichen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agar	Sigma-Aldrich	Nr. A1296
Ampicillin	Sigma-Aldrich	Nr. A9518
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycerin	Sigma-Aldrich	Nr. G5516
Kcl	Sigma-Aldrich	Nr. P9541
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
Trypton	Sigma-Aldrich	95039
Hefeextrakt	Fluka	70161
Küvetten 0,1 cm	BioRad	1652089	Für die Elektroporation
Zentrifuge 5415R	Eppendorf
Zentrifuge Allegra 21R	Beckman
Gene Pulser II Elektroporation	BioRad