Bewertung der Mutationshäufigkeit in Bakterien mit dem Beta-Glucosidase-Assay

Abstract

Quelle: Stefan, A., et al. Die vielfältigen Vorteile der Protein-Co-Expression in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (96), (2015).

Dieses Video zeigt die Bewertung der Mutationshäufigkeit in Bakterien mit Hilfe eines Beta-Glucosidase-Assays. Bakterienkulturen, die eine Korrektur-defiziente DNA-Polymerase exprimieren, werden über aufeinanderfolgende Generationen gesammelt. Replikationsfehler, die durch ein vermindertes Korrekturlesen verursacht werden, können ein unterdrücktes Beta-Glucosidase-Gen aktivieren. Nach der Zentrifugation und Permeabilisierung wird ein Substrat hinzugefügt und die Enzymaktivität gemessen, um die Mutationshäufigkeit in den Proben zu quantifizieren.

Protocol

1. Isolierung von Escherichia coli oder E. coli Co-Transformanten

1. Bereiten Sie elektrokompetente Zellen des entsprechenden E. coli-Stammes vor, die transformiert werden sollen. Eine einzelne Kolonie des Stammes ihrer Wahl wird in 1 ml Luria-Bertani (LB)-Medium (Trypton, Hefeextrakt, Natriumchlorid oder NaCl in 10, 5 bzw. 10 g/l) überführt und bei 37 °C unter Schüttelbedingungen von 180 U/min inkubiert. Die Vorkultur wird 1:500 in 25 ml frischem LB-Medium verdünnt und die Kultur bei 37 °C inkubiert.
2. In der logarithmischen Phase (0,6 O.D.) zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 5.000 x g für 20 min und resuspendieren Sie das Pellet in 10 % v/v eiskaltem, sterilem Glycerin-Wasser in der Hälfte des ursprünglichen Kulturvolumens. Wiederholen Sie diesen Schritt 4 Mal und halbieren Sie das Resuspensionsvolumen jedes Mal. Zum Schluss resuspendieren Sie das Pellet in Glycerin/Wasser und teilen die Zellsuspension in 50 μl Aliquote. Lagern Sie die Aliquots bei -80 °C bis zu 6 Monate.
3. Das gewünschte Plasmid wird in sterilem Wasser gelöst, das mit 0,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) angereichert ist. Tauen Sie ein Aliquot der elektrokompetenten Zellen auf Eis auf und mischen Sie es mit einer geeigneten Menge (2,5-5 ng) Vektor. Die Mischung in eine 0,1 cm große Küvette geben, die für die Elektroporation geeignet ist, und 1,8 kV zuführen.
4. Übertragen Sie die elektroporierten Zellen sofort in 1 ml superoptimale Brühe mit Katabolit-Repressionsmedium (SOC) (LB-Medium, ergänzt mit 0,2 % w/v Glukose, 10 mM Magnesiumchlorid oder MgCl₂, 2,5 mM Kaliumchlorid oder KCl), inkubieren Sie 1 Stunde lang unter Schütteln und übertragen Sie schließlich 100 μl Aliquots in Petrischale, die LB-Agar mit dem entsprechenden Antibiotikum enthalten. Über Nacht (O/N) bei 37 °C inkubieren.
5. Reinigen Sie die Transformanten, indem Sie einzelne Kolonien auf Petrischalen streichen.
6. Bereiten Sie elektrokompetente Zellen der primären Transformanten vor und wiederholen Sie die Schritte 1.1 bis 1.5, um mit weiteren Plasmiden zu transformieren.
7. Bereiten Sie Glycerinvorräte der Co-Transformanten vor. Eine einzelne Kolonie in LB, ergänzt mit den entsprechenden Antibiotika, wird in LB überführt, bei 37 °C unter Schütteln inkubiert und in der logaritären Phase (0,6 O.D.) die Zellsuspension bei 5.000 x g für 20 min zentrifugiert. Resuspendieren Sie das Pellet in einem LB-Antibiotika-Medium mit 15 % v/v Glycerin. In Aliquoten abgeben und bei – 80 °C lagern.

2. Mutationsanalyse von Populationen, die die Wildtyp-ε-Untereinheit der E. coli-DNA-Polymerase III und die mutagene εD12A-Variante mitexprimieren

1. Übertragen Sie eine einzelne Kolonie von E. coli TOP10, die die Vektoren pBAD-ε und pGOOD1-εD12A enthält, auf 1 ml LB-Antibiotika-Medium. O/N bei 37 °C inkubieren.
2. Die Vorkultur 1:250 wird in 3 Kolben mit frischem Medium (10 ml) verdünnt, die entsprechenden Induktoren (Arabinose, Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) oder Arabinose und IPTG, je 1 mM) zugegeben und 8 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Bereiten Sie parallel nicht-induzierte Kulturen vor.
3. Aliquote von 1 ml werden entnommen und dann 1:500 in neuen Kolben verdünnt, die frisches Medium (10 ml) enthalten, das mit den entsprechenden Induktoren ergänzt wurde oder nicht. O/N bei 37 °C inkubieren.
4. Die Schritte 2.2 und 2.3 wiederholen und Aliquote von 1 ml entnehmen.
5. Bestimmen Sie die Anzahl der Generationen, die in jeder Kultur aufgetreten sind. 100 μl geeigneter serieller Verdünnungen von Inokulum und Kultur werden auf LB-Platten übertragen. Inkubieren Sie O/N bei 37 °C. Zählen Sie die Kolonien auf den LB-Platten und berechnen Sie den Logarithmus der Anzahl der Zellen, die am Ende des Wachstums im Inokulum (log_I) und in der Kultur am Ende des Wachstums (log_C) vorhanden sind. Um die Anzahl der Generationen zu bestimmen, verwenden Sie die Formel: (log_C – log_I)/0,301.
6. Zentrifugieren Sie bei 5.000 x g für 20 min und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 50 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl), pH 7,6, 50 mM NaCl. Um die Zellen zu permeabilisieren, fügen Sie 2-3 Tropfen Chloroform hinzu und wirbeln Sie es 20 Sekunden lang.
7. Bestimmen Sie die β-Glucosidase-Aktivität jedes Aliquots in einer 96-Well-Mikroplatte unter Verwendung von p-Nitrophenyl-β-D-Glucopyranosid (PNPGluc) als Substrat. In jede Vertiefung werden 100 μl permeabilisierte Zellen und 100 μl Substrat (16 mg/ml Stammlösung in Wasser oder H₂O) gegeben. Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen in den Vertiefungen bilden. Lesen Sie die Extinktion bei 420 nm mit einem Mikroplatten-Reader und dem entsprechenden Filter ab.

Materials