Extraktion und Reinigung von Plastoglobuli aus photosynthetischen Bakterien

Zusammenfassung

Quelle: Shivaiah, K., et al. Isolierung von Plastoglobuli-Lipidtröpfchen aus pflanzlichem Blattgewebe und Cyanobakterien. J. Vis. Exp. (2022)

Das Video zeigt die Isolierung von Plastoglobuli aus Cyanobakterien. Es beginnt mit einer Kultur von Cyanobakterien und geht durch den Zellaufschluss mit mechanischer Kraft. Die Freisetzung von photosynthetischen Pigmenten deutet auf eine erfolgreiche Lyse hin. Ein Saccharose-Stufengradient wird dann verwendet, um zelluläre Komponenten nach Dichte zu trennen, so dass Plastoglobuli mit geringer Dichte oben eine deutliche Bande bilden können. Diese Fraktion wird gesammelt und für die weitere Analyse konserviert.

Protokoll

1. Isolierung von rohen Plastoglobuli

1. Extraktion von rohen Plastoglobuli aus Cyanobakterien
   1. Züchten Sie eine 50-ml-Kultur von Synechocystis sp. PCC 6803 in die stationäre Phase (ca. 7-10 Tage) und stellen Sie die Zelldichte mit einem Spektralphotometer auf eine optische Dichte bei 750 nm (OD₇₅₀) von 2,0 ein. Verwenden Sie für Kulturbedingungen BG-11-Medien und züchten Sie in einem Inkubator bei einer Lichtintensität von 150 μmol Photonen/m²/s, 2 % CO₂, 32 °C und kontinuierlichem Schütteln bei 150 Umdrehungen pro Minute (U/min).
   2. Um die Polysaccharide zu entfernen, waschen Sie die Zellen, indem Sie die 50-ml-Kultur bei 6.000 × g für 45 min bei 4 °C zentrifugieren und anschließend den Überstand entfernen. Fahren Sie fort, indem Sie die Zellen zweimal in 50 ml Puffer A waschen (Tabelle 1). Entnehmen Sie ein Aliquot des Zellhomogenats und legen Sie es vor der Zentrifugation beiseite, um es als repräsentative Gesamtzellprobe zu lagern
   3. Resuspendieren Sie das gewaschene Pellet in 25 ml Puffer A und brechen Sie die Zellen mit einer französischen Druckzelle bei 1.100 Pfund pro Quadratzoll (psi), wobei Sie den Vorgang 3× wiederholen (legen Sie die Probe zwischen jedem Zyklus auf Eis, um eine Denaturierung des Proteins zu vermeiden), bis sich die lysierte Farbe unter weißem Licht von grün zu rot-blau-grün ändert. Verwenden Sie eine vorgekühlte Zelle und führen Sie diesen Schritt im Kühlraum durch.
   4. Das resultierende Homogenat wird auf acht 3-ml-Ultrazentrifugenröhrchen verteilt, die mit maximal 2,5 mL in jedem Röhrchen gefüllt sind, und dann vorsichtig mit 400 μl Medium R überlagert, wodurch ein Stufengradient entsteht.
   5. Die Röhrchen werden vorsichtig ausbalanciert, indem bei Bedarf zusätzliches Medium R hinzugefügt wird, und 30 Minuten lang bei 150.000 × g bei 4 °C zentrifugieren. Das Thylakoid und andere schwerere Organellen (einschließlich aller Polyhydroxyalkanoatkörper) pelletieren, während Plastoglobuli leicht als gelbes, öliges Polster auf oder in der Nähe der Oberseite des Saccharosegradienten zu sehen sind (Abbildung 1C).
   6. Entnehmen Sie das resultierende schwimmende Pad aus rohen Plastoglobuli mit einer Spritze und einer 22G-Nadel und geben Sie es in ein 2-ml-Röhrchen. Kratzen Sie bei Bedarf Plastoglobuli seitlich mit der Nadelspitze von der Wand des Ultrazentrifugenröhrchens ab.
   7. Fahren Sie mit Schritt 2.2 fort. Alternativ können rohe Plastoglobuli bei -80 °C gelagert und später gereinigt werden.

Tabelle 1: Pufferrezepte für die Plastoglobuli-Isolierung aus pflanzlichem Blattgewebe oder Cyanobakterien.

Puffer-Zusammensetzungen a
Mahl-Puffer	50 mM HEPES-KOH (PH 8,0)
	5 mM Magnesiumchlorid (MgCl2)
	100 mM Sorbit
	5 mM Ascorbinsäure b
	5 mM reduziertes Cystein b
	0,05 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) b
Mittel R	50 mM HEPES-KOH (PH 8,0)
	5 mM MgCl2
Mittel R 0,2	50 mM HEPES-KOH (PH 8,0)
	5 mM MgCl2
	0,2 M Saccharose
Mittel R 0,7	50 mM HEPES-KOH (PH 8,0)
	5 mM MgCl2
	0,7 M Saccharose
Puffer A	25 mM HEPES-KOH (PH 7,8)
	250 mM Saccharose
ein. Die Endkonzentrationen jeder Pufferkomponente werden angegeben.
b. Muss am Tag der Isolierung frisch hinzugefügt werden. Während Puffer am Tag vor der Isolierung hergestellt werden können, müssen bestimmte Zutaten sowie Phosphatase- und Proteasehemmer am Tag der Isolierung frisch hinzugefügt werden.

2. Ernte von reinen Plastoglobuli

1. Cyanobakterien-Verarbeitung
   1. Erzeugen Sie einen Saccharosegradienten in vier 2,5-ml-Ultrazentrifugenröhrchen, die zuerst mit 500 μl der rohen Plastoglobuli aus Schritt 1.3 geschichtet und mit 750 μl Medium R 0,7 gemischt und dann mit 750 μl Medium R 0,2 überlagert werden.
   2. Zentrifugieren Sie den Saccharosegradienten bei 150.000 × g für 90 min bei 4 °C. Sammeln Sie die reinen Plastoglobuli (Abbildung 1C) mit einer Spritze und einer 22 G-Nadel aus der oberen Phase des Saccharosegradienten und überführen Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen.
   3. Aliquotieren Sie die reinen Plastoglobuli und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein. Direkt bei -80 °C lagern oder zu einem trockenen Pulver lyophilisieren.

Ergebnisse

Abbildung 1: Isolierung und Immunblotting von Plastoglobuli und Thylakoiden. (A) Eine repräsentative gereinigte Plastoglobuli-Probe von Z. mays vor der Extraktion aus dem Saccharosegradienten. (B) Ein...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ascorbat	BDH	BDH9242
Rinderserumalbumin	Proliant Biologisch	68700
Französische Druckzelle (Modell FA-079)	SLM/Aminco	N/A
HEPES	Sigma Aldrich	Nr. H3375
Magnesiumchlorid	Sigma Aldrich	M8266
Multitron Schüttel-Inkubator	Infors HT	N/A
Kaliumhydroxid	Fisher Chemikalien	M16050
Reduziertes Cystein	MP Biochemikalien	101444
Sorbit	Sigma Aldrich	Nr. S3889
Saccharose	Sigma Aldrich	Nr. S9378
PCC 6803	N/A	N/A
Optima MAX-TL Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	Nr. A95761