Reinigung von cyanobakteriellen Plastoglobuli mit Dichtegradient

Zusammenfassung

Quelle: Shivaiah, K., et al. Isolierung von Plastoglobuli-Lipidtröpfchen aus pflanzlichem Blattgewebe und Cyanobakterien. J. Vis. Exp. (2022).

Dieses Video zeigt die Isolierung von Plastoglobuli aus Cyanobakterien mittels Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, wobei ihre lipidreiche Natur mit geringer Dichte hervorgehoben und ihre strukturelle Erhaltung für die nachgelagerte Analyse sichergestellt wird.

Protokoll

1. Ernte von reinen Plastoglobuli

1. Cyanobakterien-Verarbeitung
   1. Herstellung eines Saccharosegradienten in vier 2,5-ml-Ultrazentrifugenröhrchen, die zuerst mit 500 μl der rohen Plastoglobuli aus Schritt 1.3 geschichtet und mit 750 μl Medium R 0,7 gemischt und dann mit 750 μl Medium R 0,2 überlagert werden (Tabelle 1)
   2. Zentrifugieren Sie den Saccharosegradienten bei 150.000 x g für 90 min bei 4 °C. Sammeln Sie die reinen Plastoglobuli (Abbildung 1C) mit einer Spritze und einer 22 G-Nadel aus der oberen Phase des Saccharosegradienten und geben Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen.
   3. Aliquotieren Sie die reinen Plastoglobuli und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein. Direkt bei -80 °C lagern oder zu einem trockenen Pulver gefriertrocknen.

Tabelle 1: Pufferrezepte für die Plastoglobuli-Isolierung aus Cyanobakterien.

Mittel R	50 mM HEPES-KOH (PH 8,0)
	5 mM MgCl2
Mittel R 0,2	50 mM HEPES-KOH (PH 8,0)
	5 mM MgCl2
	0,2 M Saccharose
Mittel R 0,7	50 mM HEPES-KOH (PH 8,0)
	5 mM MgCl2
	0,7 M Saccharose

Ergebnisse

Abbildung 1: Isolierung und Immunblotting von Plastoglobuli und Thylakoiden. (A) Eine repräsentative gereinigte Plastoglobuli-Probe von Z. mays vor der Extraktion aus dem Saccharosegradienten. (B) Ein...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HEPES	Sigma Aldrich	Nr. H3375
Magnesiumchlorid	Sigma Aldrich	M8266
Saccharose	Sigma Aldrich	Nr. S9378
PCC 6803	N/A	N/A
Optima MAX-TL Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	Nr. A95761