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1. Fütterung von Würmern mit lebenden Bakterien in Flüssigkultur
ANMERKUNG: Dieses Protokoll wird verwendet, um Würmer mit im Labor gezüchteten Bakterien unter gut gemischten Bedingungen in Flüssigkulturen zu besiedeln. Würmer können mit einzelnen Isolaten aus Reinkulturen (z.B. Krankheitserreger wie Enterococcus faecium) oder Mischungen von Isolaten (z.B. minimale Mikrobiomgemeinschaften) besiedelt werden.
- Beginnen Sie mit mit Saccharose gewaschenen, synchronisierten adulten Würmern in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Waschen Sie die Würmer einmal in 12 ml S-Puffer und entsorgen Sie den Überstand.
- Die gewaschenen Würmer werden in dem für das Experiment benötigten Volumen des S-Mediums resuspendiert. Berücksichtigen Sie das Volumen der experimentellen Bedingungen, die Anzahl der Bedingungen, unter denen die Würmer aufgeteilt werden, und die endgültigen Konzentrationen von Würmern und Bakterien.
ANMERKUNG: Die Fütterung von Würmern variiert mit der Verfügbarkeit von Bakterien, und Würmer können durch Crowding gestresst werden. Für die Besiedlung in Flüssigkulturen werden <1000 Würmer/ml und >107 KBE/ml empfohlen; 1011 KBE/ml gilt als "ad libitum" Fütterungsdichte bei E. coli. - Schleudern Sie Bakterienkulturen herunter. Gießen Sie den Überstand ab; Durch Aspiration oder Pipettieren kann der Überstand für Bakterien, die lose Pellets bilden, entfernt werden.
ANMERKUNG: Für Kulturen >5 mL in 15 mL Röhrchen umfüllen und bei ~2800 x g in einer großen Tischzentrifuge für 8-10 min schleudern. Kulturen <5 mL können in 1,5 mL Röhrchen überführt und bei 9000 x g für 1-2 min in einer kleinen Tischzentrifuge zentrifugiert werden. Stark bewegliche Bakterien (z. B. viele Pseudomonas-Arten) müssen möglicherweise 10-15 Minuten lang bei 4 °C gekühlt werden, um die Bildung eines stabilen Pellets zu erleichtern, und es kann besser sein, bei 4 °C zu zentrifugieren. - Resuspendieren Sie die Bakterienkulturen in einem Volumen S-Puffer und zentrifugieren Sie sie erneut, um sie zu pelletieren. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand wie zuvor.
- Resuspendieren Sie Bakterienkulturen in S-Medium mit der gewünschten Dichte für das Experiment zuzüglich aller Antibiotika für die Auswahl. Welche Antibiotika gegebenenfalls eingesetzt werden, hängt vom Resistenzprofil der Bakterien ab, die für die Besiedlung verwendet werden.
- Mit einer Pipettenspitze, die mit M9-Wurmpuffer beschichtet ist, der mit 0,01 % Triton X-100 (M9TX-01) ergänzt ist, pipettieren Sie die Würmer vorsichtig auf und ab, bis die Würmer vollständig in S-Medium resuspendiert sind, und geben Sie sie dann zur bakteriellen Besiedlung in Röhrchen oder Plattenvertiefungen.
- Fügen Sie jeder Wurmkultur eine Bakteriensuspension hinzu, um die gewünschte Bakterienkonzentration und das gewünschte Endvolumen zu erreichen.
- Wenn Sie eine Multi-Well-Platte für die Besiedlung verwenden, decken Sie die Platte mit einer sterilen gasdurchlässigen 96-Well-Dichtungsmembran ab.
- Inkubieren Sie mit Schütteln bei 200 U/min, um zu verhindern, dass sich Bakterien während der Inkubation ansiedeln.
2. Mechanischer Aufschluss einzelner Würmer in einem 96-Well-Format
ANMERKUNG: In diesem Abschnitt wird ein 96-Well-Plattenformatprotokoll für den mechanischen Aufschluss einzelner bakteriell besiedelter C. elegans beschrieben. Die ersten Schritte des Protokolls beschreiben ein Verfahren zur Ausscheidung von nicht anhaftenden Bakterien aus dem Wurmdarm und zur Reinigung des Äußeren der Würmer mittels Kältelähmung und Oberflächenbleichung. Diese Schritte werden saubere, lebende adulte Würmer hervorbringen, die mechanisch aufgebrochen werden können, um den Bakteriengehalt zu quantifizieren oder für weitere Experimente verwendet zu werden. Dieses Protokoll kann angepasst werden, um Bakterien in Würmern zu quantifizieren, die in Flüssigkulturen, auf Agarplatten oder aus natürlichem oder Mikrokosmos-Boden besiedelt sind.
- Legen Sie ein Aliquot von M9TX-01 zum Abkühlen auf Eis (4-5x die Anzahl der Proben in ml).
- Bereiten Sie ein Aliquot aus M9TX-01 + Bleiche (6 % Natriumhypochlorit, 1:1000 oder 1:2000 V/V, 1 mL pro Probe + 1 mL extra) vor und legen Sie es zum Abkühlen auf Eis.
- Resuspendieren Sie jede Wurmprobe in 1 ml M9TX-01 in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Die Röhrchen werden kurz (2-3 s) in einer Minizentrifuge mit niedriger Drehzahl (2.000 x g) bei 25 °C gedreht, um erwachsene Tiere zu pelletieren. Pipettieren Sie den Überstand ab und entsorgen Sie ihn, wobei Sie darauf achten müssen, das Wurmkorn nicht zu stören.
- Spülen Sie die Würmer durch Zentrifugation zweimal mit 1 ml M9TX-01 und dann einmal mit 1 ml M9-Wurmpuffer, um externe Bakterien zu reduzieren.
- Entfernen Sie nicht anhaftende Bakterien aus dem Wurmdarm.
- Jede Wurmprobe wird in 1 ml S-Medium + 2x hitzeabgetötetem OP50 in einem Kulturröhrchen resuspendiert.
- Inkubieren Sie bei 25 °C für 20-30 Minuten, um den Durchgang von nicht anhaftenden Bakterien aus dem Darm zu ermöglichen.
ANMERKUNG: Dadurch wird auch jedes extrazelluläre fluoreszierende Protein aus dem Lumen entfernt und eine klarere Visualisierung von markierten Bakterien ermöglicht, die am Darmepithel haften, insbesondere wenn säurefeste Fluorophore (z. B. mCherry, dsRed) verwendet werden.
- Oberflächenbleiche Würmer, um äußere Bakterien zu entfernen.
- Spülen Sie die gereinigten Würmer zweimal mit 1 ml kaltem M9TX-01 ab und entsorgen Sie den Überstand.
- Lassen Sie die Röhrchen 10 Minuten auf Eis (bevorzugt) oder bei 4 °C abkühlen. Dies lähmt Würmer und verhindert die Aufnahme von Bleichmitteln.
ANMERKUNG: Andere Protokolle verwenden ein chemisches Lähmungsmittel wie Levamisol; Dies ist ein etablierter Ansatz, der die Hinzufügung eines Sonderabfallstroms erfordert. - Geben Sie 1 ml eiskalten M9-Wurmpuffer + unparfümiertes Bleichmittel (8,25 % Natriumhydroxid, 1:1000 oder 1:2000 v/v) in jedes Röhrchen. Lassen Sie die Röhrchen mindestens 10 Minuten lang auf Eis (bevorzugt) oder bei 4 °C ruhen, um externe Bakterien abzutöten.
ANMERKUNG: Überschreiten Sie nicht die Konzentration des Bleichmittels von 1:1000. Selbst bei gelähmten Würmern kann es zum Tod kommen. - Bleichpuffer abpipettieren und entsorgen; Bringen Sie die Schläuche zurück zum Eis, um sicherzustellen, dass die Würmer nicht wieder pumpen, bis das Bleiche entfernt ist.
- Geben Sie 1 ml kaltes M9TX-01 in jedes Röhrchen. ~5 s in einer Minizentrifuge drehen (2.000 x g bei 25 °C); Führe die Rohre zum Eis zurück. Den Überstand entfernen und entsorgen.
- Wiederholen Sie diesen Spülschritt mit weiteren 1 ml kaltem M9TX-01 und verwerfen Sie so viel Überstand wie möglich.