Mechanischer Aufschluss einzelner Würmer zur Beurteilung der Variabilität in Wirt-Bakterien-Interaktionen

Zusammenfassung

Quelle: Taylor, M. N. et al. Verwendung von Einzelwurmdaten zur Quantifizierung der Heterogenität bei Caenorhabditis elegans-bakteriellen Interaktionen. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt die Quantifizierung der Variabilität der bakteriellen Belastung des Darms bei einzelnen Caenorhabditis elegans durch mechanische Störungen. Es beschreibt die Schritte für die Probenvorbereitung, den mechanischen Aufschluss, die serielle Verdünnung und die Koloniezählung, um Unterschiede in der Darmbakterienlast zwischen einzelnen Würmern zu bewerten.

Protokoll

1. Trennen Sie die Würmer in eine tiefe 96-Well-Platte mit Siliziumkarbid-Körnung für den mechanischen Aufschluss. Bereiten Sie die 96-Well-Disruptionsplatte wie folgt vor.
   1. Besorgen Sie sich eine sterile 2-ml-Deep-Well-96-Well-Platte und eine passende 96-Well-Plattenabdeckung aus Silikon.
      ANMERKUNG: Es ist wichtig, Platten zu verwenden, die mit den 96-Well-Adaptern für den Gewebedisruptor kompatibel sind. Winzige Unterschiede in den Außenmaßen machen den Unterschied zwischen einer Platte, die von den Adaptern entfernt werden kann, und einer, die nicht entfernt werden kann.
   2. Geben Sie mit einem sterilen Messspatel eine kleine Menge steriles Siliziumkarbid der Körnung 36 in jede Vertiefung der Platte, die einen Wurm aufnehmen soll. Verwenden Sie so viel Splitt, dass der Boden der Vertiefung kaum bedeckt ist (ca. 0,2 g pro Vertiefung). Überschüssiges Material erschwert es, eine Pipettenspitze beim Entnehmen des Inhalts an den Boden der Vertiefung zu bringen.
   3. Geben Sie 180 μl M9-Wurmpuffer in jede Vertiefung.
   4. Beschriften Sie die Spalten oder Zeilen, um anzugeben, wohin die einzelnen Proben gehen sollen, und decken Sie die Platte dann locker mit der 96-Well-Abdeckung aus Silikon ab.
2. Übertragen Sie einzelne Würmer zum Aufschluss auf die 96-Well-Platte.
   1. Bringen Sie die permeabilisierten Würmer vorsichtig in eine kleine (35 oder 60 mm) Petrischale, die ausreichend M9-Wurmpuffer enthält, ergänzt mit 0,01 % Triton X-100 (M9TX-01), um die Schale bis zu einer Tiefe von ~1 cm zu füllen.
      ANMERKUNG: Wenn eine große Anzahl von Würmern vorhanden ist, ist es möglicherweise nicht möglich, die gesamte Probe zu übertragen, da die Flüssigkeit überfüllt wird und es schwierig sein wird, einzelne Würmer zu pipettieren.
   2. Pipettieren Sie mit einem Präpariermikroskop oder einem anderen Gerät mit geringer Vergrößerung einzelne Würmer in einem Volumen von 20 μl ab und übertragen Sie diese Würmer in einzelne Vertiefungen der 96-Well-Platte.
      ANMERKUNG: Am besten erntet man nur frisch abgetötete Würmer. Vermeiden Sie Würmer mit einer starren, linearen Form, da diese Würmer möglicherweise schon seit einiger Zeit tot sind. Versuchen Sie, Würmer zu nehmen, die gekrümmt oder S-förmig sind, eine normale grobe Physiologie und einen intakten Darm haben.
   3. Stellen Sie nach dem Übertragen jedes Volumens sicher, dass der ausgewählte Wurm tatsächlich in die Vertiefung ausgestoßen wurde. Pipettieren Sie dazu 20 μl M9TX-01 aus einem freien Bereich der Petrischale und geben Sie das volle Volumen wieder in die Schale ab. Dadurch wird der Wurm normalerweise ausgeworfen, wenn er an der Pipette klebt. Wenn der Wurm feststeckte, entfernen Sie 20 μl aus der Vertiefung und versuchen Sie den Transfer erneut.
   4. Sobald alle Würmer übertragen wurden, decken Sie die 96-Well-Platte mit einem Blatt handelsüblicher flexibler Siegelfolie mit Papierrücken (2 x 2 Quadrate) ab und stellen Sie sicher, dass die papierkaschierte Seite der Siegelfolie nach unten auf die Probenvertiefungen zeigt. Achten Sie darauf, die Siegelfolie nicht zu dünn zu dehnen, da sie sich sonst später nur sehr schwer entfernen lässt.
   5. Legen Sie die Silikon-Siegelmatte leicht auf die flexible Dichtungsfolie; Drücken Sie die Abdeckung zu diesem Zeitpunkt nicht in die Vertiefungen.
   6. Den Teller auf 4 °C bringen und 30-60 Minuten kalt stellen. Dadurch wird eine Überhitzung während der Störung vermieden, die die Proben beschädigen kann.
      ANMERKUNG: Dies ist ein Haltepunkt im Protokoll. In den meisten Fällen kann die Platte vor dem Schleifen bis zu 4 h bei 4°C belassen werden. Lassen Sie die Würmer nicht über Nacht stehen, da sich dadurch die Keimzahl verändert.
3. Laden Sie 96-Well-Platten auf einen Gewebedisruptor, um Wurmgewebe aufzubrechen und Darmbakterien freizusetzen.
   HINWEIS: (Optional) Wenn Sie eine ungerade Anzahl von 96-Well-Platten für Aufschlüsse verwenden, muss vor dem Fortfahren ein Gegengewicht vorbereitet werden. Verwenden Sie eine leere, tiefe 96-Well-Platte und füllen Sie die Wells mit Wasser, bis sie das gleiche Gewicht wie die erste Platte hat.
   1. Drücken Sie die Silikon-Dichtungsmatte fest in die Vertiefungen, um eine Versiegelung zu erzeugen, und achten Sie darauf, dass der Deckel flach über die gesamte Oberfläche der Platte liegt.
      ANMERKUNG: Ist die flexible Dichtungsfolie nach dem Strecken zu dick, wird es schwierig, den Silikondeckel so zu sichern, dass er in allen Vertiefungen flach aufliegt. Dies führt zu einer unzureichenden Abdichtung und einer Kontamination von Bohrung zu Bohrung während des Schüttelns.
   2. Sichern Sie die Platten im Gewebedisruptor mit den 96-Well-Plattenadaptern. Platten 1 min bei 30 Hz schütteln, dann Platten um 180° drehen und erneut 1 min schütteln. Dies trägt dazu bei, eine gleichmäßige Unterbrechung in allen Vertiefungen der Platte zu gewährleisten.
   3. Klopfen Sie die Platten zwei- bis dreimal fest auf die Bank, um den Schmutz von der flexiblen Siegelfolie zu lösen.
   4. Drehen Sie die Platten mit einer großen Zentrifuge mit zwei 96-Well-Plattenadaptern 2 Minuten lang bei 2400 x g nach unten, um das gesamte Material auf dem Boden der Wells zu sammeln.
   5. Entfernen Sie den Silikondeckel und ziehen Sie die flexible Dichtungsfolie vorsichtig ab.
      ANMERKUNG: Wenn die flexible Siegelfolie in einer der Vertiefungen kleben bleibt, verwenden Sie eine 200-μl-Pipettenspitze, um sie zu entfernen. Dies ist häufig der Fall, wenn die flexible Siegelfolie zu dünn gedehnt wird.
4. Verdünnen Sie Wurmaufschlussproben seriell in 300 μl in 96-Well-Platten.
   1. Pipettieren Sie mit einer Multiwell-Pipette auf 200 μl mehrmals langsam und vorsichtig auf und ab, um den Inhalt der Wells erneut zu mischen, und ziehen Sie dann so viel Flüssigkeit wie möglich ab. Übertragen Sie diese Flüssigkeit in die oberen Reihen der 96-Well-Platten, die für die serielle Verdünnung von zertrümmerten Wurmproben vorbereitet sind.
   2. Entfernen Sie mit einer 96-Well-Pipette auf 20 μl dieses Flüssigkeitsvolumen aus der oberen Reihe und geben Sie es in Reihe B auf. Pipettieren Sie zum Mischen 8-10x auf und ab. Verwerfe die Tipps.
   3. Wiederholen Sie Schritt 4.2, beginnend mit den 0,1-fachen Proben in Reihe B, um 0,01-fache Verdünnungsproben in Reihe C zu erstellen.
   4. Wiederholen Sie Schritt 4.2 erneut und gehen Sie von Reihe C nach Reihe D.
   5. Platte auf festen Agar zur bakteriellen Quantifizierung. Bei monokolonisierten Würmern ist es in der Regel ausreichend, 10-20 μl Tropfen jeder Verdünnung [1x-0,001x] auf Agarplatten zu plattieren. Für die Besiedlung mit mehreren Spezies ist jede Verdünnung separat zu plattieren, indem 100 μl auf eine 10 cm große Agarplatte pipettiert werden. Sofort mit Glasbeschichtungsperlen verteilen.

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