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1. Quantifizierung der polaren Lokalisierung und Dynamik von Punkt/ICM-Komponenten
ANMERKUNG: Die folgenden Schritte sind für Bilder mit 0,129 μm pro Pixel ausgelegt, die mit 2 x 2 Binning aufgenommen wurden.
- Quantifizierung der Polarität von sfGFP (Superfolder green fluorescent protein) Fusionsproteinen (Abbildung 1)
- Passen Sie den Bildkontrast so an, dass die Bakterien gut sichtbar sind. Verwenden Sie das Bereichswerkzeug, um ein Rechteck von 0,25 x 1,3 μm2 zu platzieren, das am Pol beginnt und sich in das Zytoplasma erstreckt. Das Rechteck muss genau innerhalb der Bakteriengrenzen bleiben.
- Markieren Sie mindestens 200 Bakterien, und verwenden Sie die Schaltfläche Zu maskierender Bereich, um Masken für die gewünschten Bereiche zu erstellen. Wählen Sie unter Maskenstatistik und Maskenbereich die Option Objekt aus. Markieren Sie dann unter Features und Intensität die Markierung Mittlere Intensität und Varianz.
- Exportieren Sie die Daten und berechnen Sie die Polaritätswerte jedes Bakteriums als Verhältnis zwischen der Varianz und der mittleren Intensität.
- Verwenden Sie für Anwendungen mit hohem Durchsatz ein Phasenobjektiv und einen geeigneten Kondensoraufbau, um Bilder mit dem Phasen- und dem 488-nm-Kanal aufzunehmen. Achten Sie darauf, Sichtfelder zu wählen, in denen die Bakterien vollständig abgeschieden sind.
- Stellen Sie den Phasenkanalkontrast des Bildes auf ein Niveau ein, bei dem die Bakterien deutlich sichtbar sind. Öffnen Sie das Dual-Channel-Bild, öffnen Sie das Fenster " Segmentmaske erstellen " und ändern Sie den Kanal in die Phase.
- Passen Sie einen geeigneten Schwellenwert an und entfernen Sie kleine Objekte mit der Schaltfläche Objekte definieren . Wählen Sie unter Maske verfeinern die Option Kantenobjekte entfernen aus, und trennen Sie später Masken von Bakterien, die aneinander angrenzen.
- Berechnen Sie die Polaritätswerte des Signals im Kanal 488 für jede Zelle, wie zuvor in den Schritten 1.1.2 bis 1.1.3 beschrieben.
- Quantifizierung der Dynamik von sfGFP-Fusionsproteinen (Abbildung 2)
ANMERKUNG: Dynamik wird als Änderung der Intensität im Laufe der Zeit definiert, und die folgenden Schritte sind für kurze Bildgebungszeiträume (d. h. mehrere Minuten) ausgelegt. Fügen Sie dem Pad die entsprechenden Ergänzungen hinzu, wenn längere Bildgebungszeiten gewünscht werden.- Markieren Sie im Fenster "Image Capture " die Option "Zeitraffer", geben Sie die Zeit der Intervalle in das Feld "Intervall" ein, und geben Sie 2 in das Feld "# der Zeitpunkte" ein. Es werden zwei aufeinanderfolgende Bilder von Legionella pneumophila aufgenommen, die das fluoreszierende Protein von Interesse exprimieren.
- Passen Sie den Bildkontrast an, bis die Zellen deutlich sichtbar sind. Befolgen Sie Abbildung 2A und die Beschreibungen unten, um drei verschiedene Masken zu platzieren. Verwenden Sie das Bereichswerkzeug, um ein Quadrat von 0,25 x 0,25 μm in der Mitte von mindestens 400 Zellen zu platzieren.
- Verwenden Sie die Schaltfläche Zu maskierender Bereich , um eine Maske (Maske 1) der gewünschten Quadrate zu erstellen. Erstellen Sie eine neue leere Maske (Maske 2) und markieren Sie mit dem Pixelwerkzeug oder dem Polygonwerkzeug die gesamte Zellfläche von mindestens 25 zufälligen Zellen, die zur Berechnung der Fluoreszenzbleiche verwendet werden. Erstellen Sie eine neue leere Maske (Maske 3) und verwenden Sie das große Pinselwerkzeug, um Bereiche zwischen den Zellen zu markieren, die für die Hintergrundsubtraktion verwendet werden.
- Wählen Sie unter Maskenstatistik und Maskenumfang die Option Objekt für Maske 1 und Maske 2 aus. Wählen Sie dann unter Features und Intensität die Option Mittlere Intensität aus, und exportieren Sie die Daten der beiden Masken. Exportieren Sie für Maske 3 die mittlere Intensität der gesamten Maske.
- Berechnen Sie die Änderung der Fluoreszenzintensität für jedes Objekt in Maske 1 mit den folgenden Formeln:
Dabei ist Maske 1 ein Quadrat von 0,25 μm × 0,25 μm, das in der Zellmitte platziert ist, Maske 2 deckt die gesamte Zelle ab, Maske 3 ist der Hintergrund zwischen den Zellen, t1 ist die mittlere Intensität im ersten Zeitpunkt und t2 ist die mittlere Intensität im zweiten Zeitpunkt.
