Aufbereitung von Legionella pneumophila für die kryogene Elektronentomographie

Zusammenfassung

Quelle: Chetrit, D., et al. Anwendung von Lebendzellbildgebung und Kryo-Elektronentomographie zur Aufklärung räumlich-zeitlicher Merkmale des Legionella pneumophila dot/icm-Sekretionssystems. J. Vis. Exp. (2020)

Das Video beschreibt, wie Legionella pneumophila-Proben für die Kryo-Elektronentomographie durch Kombination von Bakterienkultur, Markierung von Goldnanopartikeln und Vitrifikationstechniken vorbereitet werden. Das Verfahren bewahrt native zelluläre Strukturen und ermöglicht eine hochauflösende Bildgebung von Komponenten des membranassoziierten Sekretionssystems.

Protokoll

1. Detektion der sfGFP-Massendichte mit Kryo-ET

1. Probenvorbereitung, Datenerfassung und Rekonstruktion

1. Züchten Sie einen schweren Fleck von Legionella pneumophila , der ein fluoreszenzmarkiertes Dot/Icm-Protein auf CYE-Agar-Streptomycin-Platten für 48 Stunden bei 37 °C exprimiert. Resuspendieren Sie die Zellen in ddH₂O auf einen OD₆₀₀ von 0,7. 5 μl kolloidale Goldpartikel (BSA Tracer, 10 nm) zu 20 μl der Zellsuspension geben.

2. 5 μL des Zellgemisches auf ein frisch entladenes, löchriges Kohlenstoffgitter (R 2/1 auf Cu 200 mesh) pipettieren und 1 min stehen lassen. Mit Filterpapier abtupfen und mit einem schwerkraftbetriebenen Kolben in flüssigem Ethan einfrieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 nm kolloidale Goldpartikel	Aurion	25486
100x Plan-Apo-Ziel (1,4 NA)	Nikon
ASSE	Sigma-Aldrich	Nr. A9758
CoolSNAP EZ 20 MHz digitale Monochrom-Kamera	Photometrie
Genrahmen, 1,7x2,8 cm, 125 μL	Fisher Scientific	AB-0578
Holey Carbon Gitter R 2/1 Cu 200 mesh	Quantifoil	Q225-CR1
Eisen(III)-nitrat-Nonahydrat	Sigma-Aldrich	216828
K2 Summit Kamera für Kryo-EM	GATAN
Mikroskop-Abdeckfolien 22x22 mm	Fisher Scientific	12-542B
Mikroskop-Abdeckfolien 24x50 mm	Fisher Scientific	12-545 KB
Objektträger 25x75x1 mm	Globus Wissenschaftlich	1380
DiaBook 6.0	Innovationen in der intelligenten Bildgebung
Spectra X Lichtmaschine	Lumencor