Kultivierung des schnell wachsenden Bakteriums Vibrio natriegens

Zusammenfassung

Quelle: Wiegand, D. J., Lee, et al., Zellfreie Proteinexpression unter Verwendung des schnell wachsenden Bakteriums Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt den Anbau und die Ernte von Vibrio natriegens, einem schnell wachsenden Bakterium, unter belüfteten Bedingungen, um Bakterienpellets für die Herstellung von Rohextrakten vorzubereiten.

Protokoll

Zubereitung von Vibrio natriegens Rohzellextrakt – Bakterienkultur

1. Bereiten Sie das bakterielle Wachstumsmedium LB-V2 (Lysogenie-Bouillon mit V2-Salzen) gemäß Tabelle 1 vor. Sterilisieren Sie die Wachstumsmedien durch Autoklavieren. Lassen Sie das Medium Raumtemperatur (RT) erreichen. Lagern Sie überschüssige Medien bei RT.
   VORSICHT: Tragen Sie beim Betrieb eines Autoklaven geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) und beachten Sie die laborspezifischen Anweisungen.
2. Verwenden Sie einen Glycerinstamm von Wildtyp-V . natriegens , um 3 ml LB-V2-Medien zu inokulieren. Anbau über Nacht bei 30 °C und Schütteln bei 225 U/min.
3. Waschen Sie 1 mL der Übernachtkultur durch Zentrifugation bei 10.600 x g auf einer Tischzentrifuge für 1 min. Der Überstand wird aspiriert, ohne das resultierende Pellet zu stören, und in 1 mL frischem LB-V2-Medium resuspendiert.
4. In einen autoklavierten 4-Liter-Erlenmeyerkolben mit sterilem Deckel 1 l frisches LB-V2-Wachstumsmedium geben. Mit 1 ml gewaschener Übernachtkultur impfen (Verdünnungsverhältnis 1:1.000). Züchten Sie die Kultur bei 30 °C und schütteln Sie sie bei 225 U/min.
   HINWEIS: V. natriegens-Kulturen können unter Beibehaltung des Verdünnungsverhältnisses von 1:1.000 nach oben oder unten skaliert werden. Geben Sie z. B. 250 μl gewaschene Übernachtkultur zu 250 ml frischem LB-V2-Wachstumsmedium in einem 2-Liter-Erlenmeyerkolben mit sterilem Deckel.
5. Überwachen Sie den OD₆₀₀ der Kultur mit einem Spektralphotometer. Wenn die Kultur OD₆₀₀ = 1,0 ± 0,2 erreicht, Kultur durch Zentrifugation bei 3.500 x g für 20 min bei 4 °C ernten. Pellet auf Eis legen.
   HINWEIS: V. natriegens wächst schnell, so dass eine genaue Überwachung der Kultur erforderlich ist. Das Wachstum auf OD₆₀₀ = 1,0 sollte bei einem Verdünnungsverhältnis von 1:1.000 etwa 1,5-2 Stunden dauern.
6. Aspirieren Sie den Überstand und lagern Sie das resultierende Bakterienpellet sofort bei -80 °C oder fahren Sie direkt mit der Zelllyse fort.
   ANMERKUNG: Dieser Schritt ist ein guter Halt. Es wird jedoch empfohlen, das Pellet sofort oder innerhalb von 1-2 Tagen zu verarbeiten, um beste Ergebnisse zu erzielen.

Tabelle 1: Reagenzien für die Herstellung von 1 l LB-V2 bakteriellem Wachstumsmedium

Tabelle 1 A	Herstellung von LB-V2 bakteriellen Wachstumsmedien
Bestandteil	Menge (g)	Endkonzentration (mM)	Endvolumen (L)
LB Brühe (Müller)	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
Kcl	0.31	4.2
Tabelle 1 B	Vorbereitung von S30A Lysepuffer
Bestandteil	Menge (g)	Endkonzentration (mM)	Endvolumen (L)
Tris-Lösung (pH 8,0) - 1 M (ml)	25	50	0.5
Mg-Glutamat	2.72	14
K-Glutamat	6.10	60
Dithiothreitol (DVB-T) - 1 M (ml)	1	2

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2 mL Röhrchen	Eppendorf	22363352
HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure)	Sigma	Nr. H3375
LB (Luria-Bertani) Brühe (Müller)	Sigma	Nr. L3522
Magnesiumchlorid (MgCl₂)	Sigma	M8266
Kaliumchlorid (KCl)	Sigma	Nr. 9333
Natriumchlorid (NaCl)	Sigma	Nr. S7653
Tris-Lösung (pH 8,0) - 1 m	Invitrogen	AM9856
Vibrio natriegens (Wildtyp) Lyophilisierter Stamm	ATCC	14048