Aufbereitung von Rohzellextrakt aus Vibrio natriegens

Zusammenfassung

Quelle: Wiegand, D. J., et al. Zellfreie Proteinexpression mit dem schnell wachsenden Bakterium Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt die Herstellung eines Zellextrakts aus Vibrio natriegens, einem schnell wachsenden Bakterium, das für seine hohe Proteinsyntheserate bekannt ist. Das Bakterienpellet wird vor der Beschallung auf Eis gewaschen und in Lysepuffer resuspendiert, um einen zellulären Abbau zu verhindern. Das Lysat wird zentrifugiert, um unlösliche Zelltrümmer zu trennen, und der Zellextrakt wird gesammelt, schockgefroren und für die zukünftige Verwendung gelagert.

Protokoll

1. Herstellung von Rohzellextrakten aus V. natriegens – Bakterienkultur

1. Bereiten Sie V. natriegens bakterielle Wachstumsmedien, Lysogen-Bouillon Version 2 (LB-V2) gemäß Tabelle 1 vor. Sterilisieren Sie die Wachstumsmedien durch Autoklavieren. Lassen Sie das Medium Raumtemperatur (RT) erreichen. Lagern Sie überschüssige Medien bei RT.
   VORSICHT: Tragen Sie beim Betrieb eines Autoklaven geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) und beachten Sie die laborspezifischen Anweisungen.
2. Verwenden Sie einen Glycerinstamm von Wildtyp-V . natriegens , um 3 ml LB-V2-Medien zu inokulieren. Anbau über Nacht bei 30 °C und Schütteln bei 225 U/min.
3. Waschen Sie 1 mL der Übernachtkultur durch Zentrifugation bei 10.600 x g auf einer Tischzentrifuge für 1 min. Der Überstand wird aspiriert, ohne das resultierende Pellet zu stören, und in 1 mL frischem LB-V2-Medium resuspendiert.
4. In einen autoklavierten 4-Liter-Erlenmeyerkolben mit sterilem Deckel wird 1 l frisches LB-V2-Wachstumsmedium gegeben. Mit 1 ml gewaschener Übernachtkultur impfen (Verdünnungsverhältnis 1:1.000). Züchten Sie die Kultur bei 30 °C und schütteln Sie sie bei 225 U/min.
   HINWEIS: V. natriegens-Kulturen können unter Beibehaltung des Verdünnungsverhältnisses von 1:1.000 nach oben oder unten skaliert werden. Geben Sie z. B. 250 μl gewaschene Übernachtkultur zu 250 ml frischem LB-V2-Wachstumsmedium in einem 2-Liter-Erlenmeyerkolben mit sterilem Deckel.
5. Überwachen Sie den OD₆₀₀ der Kultur mit einem Spektralphotometer. Wenn die Kultur OD₆₀₀ = 1,0 ± 0,2 erreicht, die Kultur durch Zentrifugation bei 3.500 x g für 20 min bei 4 °C ernten. Das Pellet auf Eis legen.
   HINWEIS: V. natriegens wächst schnell, so dass eine genaue Überwachung der Kultur erforderlich ist. Das Wachstum auf OD₆₀₀ = 1,0 sollte bei einem Verdünnungsverhältnis von 1:1.000 etwa 1,5-2 Stunden dauern.
6. Aspirieren Sie den Überstand und lagern Sie das resultierende Bakterienpellet sofort bei -80 °C oder fahren Sie direkt mit der in Abschnitt 2 beschriebenen Zelllyse fort.
   ANMERKUNG: Dieser Schritt ist ein guter Halt. Es wird jedoch empfohlen, das Pellet sofort oder innerhalb von 1-2 Tagen zu verarbeiten, um beste Ergebnisse zu erzielen.

2. Herstellung von Rohzellextrakten aus V. natriegens – Zelllyse

1. Bereiten Sie den S30-Lysepuffer gemäß Tabelle 1 in sterilem deionisiertem (DI) Wasser vor und stellen Sie den pH-Wert mit Eisessig auf 7,7 ein.
   VORSICHT: Eisessig sollte bei der Einstellung des pH-Werts mit der richtigen PSA gehandhabt werden.
2. Kühlen Sie den S30-Lysepuffer im Kühlschrank oder auf Eis auf ca. 4 °C ab, bevor Sie mit der Zelllyse beginnen.
   ANMERKUNG: Für eine schnelle Abkühlung kann der Lysepuffer bei -20 °C platziert werden. Lassen Sie den Puffer nicht einfrieren.
3. Legen Sie die Zellpellets 10-20 Minuten lang auf Eis oder bis sie vollständig aufgetaut sind. Alle Pellets, die aus derselben 1-Liter-Kultur stammen, werden mit 10 ml kaltem S30-Lysepuffer resuspendiert und die Suspension dann in ein 50-ml-Röhrchen überführt. Wenn die Pellets in Schritt 1.6 nicht bei -80 °C im Gefrierschrank eingefroren wurden, gehen Sie direkt zur Resuspension über.
   ANMERKUNG: Erhöhen Sie das Volumen des S30-Lysepuffers, der zur anfänglichen Resuspendierung von Pellets verwendet wird, nach Bedarf.
4. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 3.500 x g für 10 min bei 4 °C. Den Überstand ansaugen, ohne das Pellet zu stören. Waschen Sie das Pellet ein zweites Mal mit 10 ml kaltem S30-Lysepuffer. Lege das Pellet auf Eis.
5. Geben Sie in einem Kühlraum 500 μl kalten S30-Lysepuffer zu dem Pellet im 50-ml-Röhrchen. Suspendieren Sie das Pellet mit einer Pipettenspitze mit breiter Bohrung und übertragen Sie die gesamte Pelletsuspension vorsichtig in ein 2-ml-Röhrchen.
   ANMERKUNG: Wenn keine Pipette mit breitem Durchgang verfügbar ist, schneiden Sie mit einer Schere das Ende einer 1-ml-Pipettenspitze ab, um die Bohrung für den Pellettransfer zu vergrößern.
   1. Übertragen Sie so viel Pellet wie möglich, ohne das Volumen wesentlich zu erhöhen. Das Pellet sollte jedoch in genügend Flüssigkeit resuspendiert werden, um beschallt zu werden, was durch eine homogene Suspension im 2-ml-Röhrchen angezeigt wird. Überfüllen Sie das 2-ml-Röhrchen nicht. Die Suspension sollte 1,5 ml nicht überschreiten; Bei Bedarf in mehrere Röhren aufteilen.
6. Bewahren Sie das Zellpellet auf Eis auf und arbeiten Sie in einem kalten Raum. Füllen Sie ein 600-ml-Becherglas mit Eis und legen Sie einen 2-ml-Röhrchenhalter auf das Eis.
   ANMERKUNG: Es ist hilfreich, den Röhrchenhalter in der Nähe der Seite des Becherglases zu platzieren, damit die Pelletsuspension im Eis sichtbar ist, um den Fortschritt der Beschallung zu überwachen (siehe Abbildung 1).
7. Vortex-suspendiertes Pellet in einem 2-ml-Röhrchen kurz, um die Zellen zu homogenisieren, schnippen Sie die Röhrchen, um alle Zellen auf der Unterseite der Kappe zu entfernen, und legen Sie sie mit geöffneter Kappe in den Röhrchenhalter. Senken Sie die Spitze des Ultraschallgeräts so in die Suspension, dass sie sich knapp unter der Flüssigkeitsoberfläche befindet.
8. Bereiten Sie die Beschallungseinrichtung wie in Abbildung 2 dargestellt mit einem Ultraschallgerät und einer Sonde mit einem Spitzendurchmesser von 1/8 Zoll vor. Geben Sie die folgenden Einstellungen in die Steuerung des Ultraschallgeräts ein: 20 kHz Frequenz und 50 % Amplitude, Impuls-Einschaltzeit: 10 s, Impuls-Aus-Zeit: 60 s.
9. Führen Sie das Pulsbeschallungsprotokoll drei Zyklen lang durch. Wenn das Gesamtvolumen der Pelletsuspension > 500 μl beträgt, führen Sie das Pulsbeschallungsprotokoll sechsmal durch.
   ANMERKUNG: Im Allgemeinen reichen 3-6 Pulse aus, um V . natriegens-Pellets zu lysieren; Je nach Ultraschallgerät können zusätzliche Impulse erforderlich sein. Verwenden Sie während der Beschallung die Einstellknopfplattform, um die Sonde auf und ab zu bewegen, um alle Pellets zu lysieren, die sich möglicherweise am Boden des Rohrs abgesetzt haben. Das Röhrchen kann aus dem Halter entnommen und kurz vortext werden, um die Suspension zwischen den Impulsen wieder zu homogenisieren.
   VORSICHT: Tragen Sie einen geeigneten Gehörschutz, wenn das Ultraschallgerät aktiv ist.
10. Nach der Beschallung zentrifugieren Sie den Rohzellextrakt bei 16.000 x g für 30-45 min bei 4 °C oder bis das Lysat frei von Zelltrümmern ist, wie in Abbildung 3 dargestellt.
11. In einem Kühlraum aliquotieren Sie 50 μl der resultierenden Überstände auf neue 2 ml-Röhrchen, ohne das Pellet zu stören.
    ANMERKUNG: Alle Ablagerungen, die versehentlich in die neuen 2-ml-Röhrchen übertragen werden, verringern die Kapazität des Extrakts für eine ertragreiche Proteinsynthese drastisch.
12. Rohzellextrakte werden schockgefroren, indem die Röhrchen in einen Röhrchenhalter eingelegt werden, an dem ein Tauchstring befestigt ist, wie in Abbildung 4 dargestellt. Tauchen Sie die Röhrchen in einen Dewar, der flüssigen Stickstoff enthält, und stellen Sie sie sofort bis zur Verwendung bei -80 °C in einen Gefrierschrank. VORSICHT: Verwenden Sie geeignete PSA für den Umgang mit flüssigem Stickstoff, einschließlich eines Laborkittels, einer Schutzbrille, eines Gesichtsschutzes, einer Kryoschürze und Handschuhe.

Tabelle 1: Reagenzien für die Herstellung von 1 l LB-V2 bakteriellen Wachstumsmedien und 0,5 l S30A Zelllysepuffer.

Tabelle 1 A	Herstellung von LB-V2 bakteriellen Wachstumsmedien
Bestandteil	Menge (g)	Endkonzentration (mM)	Endvolumen (L)
LB Brühe (Müller)	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
Kcl	0.31	4.2
Tabelle 1 B	Vorbereitung von S30A Lysepuffer
Bestandteil	Menge (g)	Endkonzentration (mM)	Endvolumen (L)
Tris-Lösung (pH 8,0) - 1 M (ml)*	25	50	0.5
Mg-Glutamat	2.72	14
K-Glutamat	6.10	60
Dithiothreitol (DVB-T) - 1 M (ml)*	1	2

Ergebnisse

Abbildung 1: Eine Nahaufnahme des Becherglas- und Röhrchenhalters auf der Beschallungsplattform.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 mL Röhrchen	Corning	352196
2 mL Röhrchen	Eppendorf	22363352
50 mL Röhrchen	Corning	352070
Dewargefäß - 4L	ThermoScientific	10-194-100C
L-Glutaminsäure, Hemimagnesiumsalz, Tetrahydrat	Sigma	49605
L-Glutaminsäure, Kaliumsalz, Monohydrat	Sigma	Nr. G1149
LB Brühe (Müller)	Sigma	Nr. L3522
Magnesiumchlorid (MgCl₂)	Sigma	M8266
Kaliumchlorid (KCl)	Sigma	Nr. 9333
Kaliumhydroxid Pellets	Sigma/Roche	1050121000
Q125 Ultraschallgerät und CL-18 Sonde	Qsonica	4422
Natriumchlorid (NaCl)	Sigma	Nr. S7653
Vibrio natriegens (Wildtyp) Lyophilisierter Stamm	ATCC	14048