Zellfreie Proteinexpression unter Verwendung eines bakteriellen Rohzellextrakts

Zusammenfassung

Quelle: Wiegand, D. J., et al. Zellfreie Proteinexpression unter Verwendung des schnell wachsenden Bakteriums Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt die Verwendung eines bakteriellen zellfreien Proteinexpressionssystems auf Basis von Vibrio natriegens Rohlysat zur Durchführung einer gekoppelten in vitro Transkription und Translation. Beleuchtet wird die Herstellung eines Mastermixes mit essentiellen Komponenten und die schrittweise Synthese funktioneller Proteine aus einem DNA-Template.

Protokoll

1. Herstellung von zellfreien Reaktionskomponenten

1. Allgemeine Reaktionskomponenten
   1. Bereiten Sie Arbeitsvorräte mit Mg-Glutamat und K-Glutamat in 50-ml-Röhrchen mit sterilem DI-Wasser (deionisiert) in Konzentrationen von 100 mM bzw. 2000 mM vor.
   2. Bereiten Sie ein Arbeitsmaterial von 50 % (w/v) Polyethylenglykol (PEG)-8000 vor, indem Sie 100 ml steriles DI-Wasser in ein 250-ml-Becherglas geben. Legen Sie einen kleinen Magnetrührer in das Becherglas. 50 g PEG-8000 abwiegen und zu den 100 ml Wasser im Becherglas hinzufügen.
   3. Das Becherglas auf eine auf 100 °C eingestellte erhitzte Rührplatte stellen und bei 250 U/min rühren, bis PEG-8000 in Lösung ist. Lassen Sie die flüssige Mischung PEG-8000 abkühlen, bevor Sie sie in 50-ml-Röhrchen umfüllen.
2. Mastermix für Energielösungen
   1. Bereiten Sie eine 5 M Lösung von KOH vor, indem Sie 140 g KOH-Pellets zu 500 ml sterilem DI-Wasser hinzufügen.
      VORSICHT: Bereiten Sie diese Lösung in einer chemischen Haube vor und tragen Sie PSA, wenn Sie mit starken Untergründen umgehen. Die Lösung wird heiß, daher muss der Flaschenverschluss locker sein, um einen Druckaufbau zu verhindern. Lassen Sie die KOH-Lösung vor der Verwendung RT erreichen.
   2. Bereiten Sie einen 1750 mM HEPES-KOH-Puffer vor, indem Sie 20,85 g HEPES in eine 100-ml-Flasche geben. Fügen Sie langsam steriles DI-Wasser hinzu, bis das Volumen 40 mL erreicht. Vortex-Flasche zum Auflösen des HEPES. Verwenden Sie die 5 M KOH-Lösung, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen, und bringen Sie dann das Lösungsvolumen auf 50 ml.
      VORSICHT: KOH sollte bei der Einstellung des pH-Werts mit der richtigen PSA gehandhabt werden.
   3. Die restlichen 10x Energie-Mastermix-Stammkomponenten in den in Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen in sterilem VE-Wasser zubereiten und jede Brühe auf Eis legen. Tauen Sie die 100 mM ATP-, GTP-, CTP- und UTP-Bestände bei RT auf und legen Sie sie auf Eis.
      ANMERKUNG: Mit einem auf 37 °C und 350 U/min eingestellten Thermomixer können bei Bedarf Reagenzien in der Lösung aufgelöst werden. Überhitzung und lassen Sie die Reagenzien nicht über einen längeren Zeitraum auf dem Thermomixer.
   4. In ein 15-ml-Röhrchen geben Sie jede Mastermix-Komponente der Energielösung in Übereinstimmung mit der in Tabelle 1 angegebenen Reihenfolge und dem Volumen. Wirbeln Sie die Lösung nach jeder Zugabe der Komponente. Dies ergibt 5 ml Mastermix mit 10-facher Energielösung.
   5. Teilen Sie den Mastermix mit 10-facher Energielösung in 200 μl Aliquots in 2 mL Röhrchen auf. Jedes Aliquot schockfrosten. Legen Sie sie sofort bis zur Verwendung in den -80 °C heißen Gefrierschrank.
3. Aminosäure-Mastermix
   1. Um einen frischen 4x Aminosäuren Mastermix zuzubereiten, beginne damit, jede Aminosäurebrühe bei RT aufzutauen und dann auf Eis zu legen. Verwenden Sie einen Wirbel und/oder Thermomixer, der auf 37 °C und 350 U/min eingestellt ist, um sicherzustellen, dass alle Aminosäurevorräte vollständig aufgelöst sind.
      ANMERKUNG: Cystein löst sich möglicherweise nicht vollständig auf; Es kann dem Aminosäure-Mastermix als Suspension zugesetzt werden. Überhitzung und lassen Sie die Reagenzien nicht über einen längeren Zeitraum auf dem Thermomixer.
   2. Geben Sie in einem 15-ml-Röhrchen das entsprechende Volumen an Aminosäuren in steriles DI-Wasser, so dass die Endkonzentration jeder Aminosäuren 8 mM in der folgenden Reihenfolge beträgt: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, HIS, IIE, LYS, MET, PHE, PRO, SER, THR, VAL, TRP, TYR, LEU und CYS. Nachdem Sie jede Aminosäure hinzugefügt haben, wirbeln Sie die Mastermix-Lösung ein. Die in Tabelle 1 aufgeführten Volumina machen 2,4 ml Aminosäure-Mastermix aus.
   3. Teilen Sie den 4x Aminosäuren Mastermix in 200 μL Aliquots in 2 mL Röhrchen auf. Jedes Aliquot schockfrosten. Sofort bis zur Verwendung bei -80 °C in den Gefrierschrank stellen.
4. Herstellung eines reaktionsfertigen Plasmid-DNA-Templates
   ANMERKUNG: Die zellfreie Proteinexpression in diesem System wurde unter Verwendung des Super Folder Green Fluorescent Protein (GFP)-Expressionsvektors T7-pJL1-sfGFP (Table of Materials) optimiert. Es wird empfohlen, dieses Plasmid als Kontrolle für die zellfreie Reaktionseffizienz und als pJL1-Rückgrat für die Klonierung und Expression anderer Proteinsequenzen zu verwenden. Andere Plasmid-DNA-Templates können verwendet werden; Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass die Transkription durch eine T7-Promotorsequenz und das Vorhandensein von T7-RNA-Polymerase gesteuert wird. Im Folgenden wird ein einfaches Protokoll für die großtechnische Produktion eines beliebigen Plasmid-DNA-Templates aus transformierten E. coli beschrieben.
   1. Reinigen Sie den gewünschten Vektor mit einem Plasmid-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialtabelle). HINWEIS: Es wird empfohlen, das Plasmid-DNA-Template so weit wie möglich zu konzentrieren, um die engen Volumenbeschränkungen der zellfreien Reaktion zu erfüllen. Im Allgemeinen sollte ein Arbeitsbestand von 750-1500 ng/μl angestrebt werden.

2. Durchführung zellfreier Proteinexpressionsreaktionen mit dem Rohextrakt von V. natriegens

1. Zellfreie Proteinexpression mittels Plasmid- oder linearem DNA-Template
   1. 10x Energielösungs-Mastermix und 4x Aminosäure-Mastermix-Aliquote aus dem -80 °C-Gefrierschrank nehmen, bei RT auftauen und auf Eis legen. Nehmen Sie die T7-RNA-Polymerase und RNase-Inhibitor-Brühen aus dem -20 °C-Gefrierschrank und legen Sie sie auf Eis. Tauen Sie die DNA-Vorlage bei RT auf und legen Sie sie auf Eis.
   2. Bereiten Sie einen zellfreien Reaktions-Mastermix gemäß Tabelle 2 vor, indem Sie jede Komponente in der folgenden Reihenfolge in ein 2-ml-Röhrchen auf Eis geben: Aminosäure-Mastermix, Energielösungsmastermix, Mg-Glutamat, K-Glutamat, DNA-Template, PEG-8000, T7-RNA-Polymerase und RNase-Inhibitor. Bewegen Sie die Röhre nach jeder Zugabe zum Mastermix vorsichtig.
      ANMERKUNG: Wenn ein lineares Template für die zellfreie Proteinexpression verwendet werden soll, fügen Sie 5-10x mehr Material im Vergleich zum Plasmid-Template hinzu, um nennenswerte Proteinausbeuten zu erzielen.
   3. Das Rohzelllysat von V. natriegens aus den -80 °C-Gefrierschränken nehmen und 10-20 Minuten auf Eis legen, bis es aufgetaut ist. Geben Sie das entsprechende Volumen an Rohzellextrakt in den zellfreien Reaktions-Mastermix gemäß Tabelle 2 und mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab schnippen oder pipettieren.
   4. Endpunkt-Zell-freie Proteinexpression mit einem Thermocycler
      1. Pipettieren Sie 10 μl des zellfreien Reaktions-Mastermixes auf den Boden einer 96- oder 384-Well-PCR-Platte. Zwischen jedem Transfer auf die PCR-Platte mischen Sie den Mastermix, indem Sie das Röhrchen leicht anschlagen.
         ANMERKUNG: Zellfreie Reaktions-Mastermixe sollten jederzeit gut gemischt werden, um die Reproduzierbarkeit der Reaktion und die zellfreie Proteinexpression in allen Proben zu maximieren.
   5. Zentrifugieren Sie die Platte kurz bei 1.000 x g für 10 s, um eventuellen Mastermix, der an den Seiten der Vertiefungen hängen geblieben ist, zu sammeln. Versiegeln Sie die Vertiefungen mit einem Plattenkleber, um eine Verdunstung zu verhindern, und legen Sie die PCR-Platte dann in einen Thermocycler, der auf 26 °C und einen beheizten Deckel auf 105 °C eingestellt ist.
      ANMERKUNG: Die gleichmäßige Wärmeverteilung und der beheizte Deckel eines Thermocyclers verbessern die Proteinexpressionsausbeute erheblich.
   6. Inkubieren Sie die zellfreien Reaktionen für mindestens 3 Stunden. Nach der Inkubation können exprimierte Proteine gereinigt, quantifiziert und für nachgelagerte Prozesse verwendet werden.
      ANMERKUNG: Exprimierte Proteine können in der zellfreien Reaktion mit einer Methode nach Wahl des Anwenders direkt quantifiziert werden. So können beispielsweise fluoreszierende Proteine mit einer externen Standardkurve quantifiziert werden, oder die Radioaktivität kann gemessen werden, wenn eine radioaktiv markierte Aminosäure in der zellfreien Reaktion verwendet wird. UV-sichtbare Spektroskopie oder Totalprotein-Assays werden in der Regel nicht empfohlen, um die Proteinproduktion in zellfreien Reaktionen ohne vorherige Aufreinigung direkt zu messen.

Tabelle 1: Reagenzien für die Herstellung von 5 mL Mastermix mit 10x Energielösung und 2,4 mL Mastermix mit 4x Aminosäuren.

Zubereitung von 10x Energy Solution Master Mix
Bestandteil	Bestandskonzentration (mM)	Endkonzentration (mM)	Menge (μL)	Endvolumen (μL)
HEPES-KOH pH 8	1750	500	1428.57	5000
ATP	100	15	750.00
Zum GTP	100	15	750.00
CTP	100	9	450.00
UTP	100	9	450.00
tRNA aus E. coli MRE 600 (mg/ml)*	100	2	100.00
Coenzym A Hydrat	200	2.6	65.00
NAD	200	3.3	82.50
Lager	650	7.5	57.69
Folinsäure	100	0.7	35.00
Spermidin	1600	10	31.25
3-PGA (Englisch)	2000	300	750.00
Steriles deionisiertes Wasser			49.99
	Zubereitung von 4x Aminosäuren Master Mix
Bestandteil	Bestandskonzentration (mM)	Endkonzentration (mM)	Menge (μL)	Endvolumen (μL)
ALA	168	8	114.3	2400
ARG	168	8	114.3
ASN	168	8	114.3
NATTER	168	8	114.3
GLN	168	8	114.3
GLU	168	8	114.3
GLY	168	8	114.3
SEINE	168	8	114.3
IIE	168	8	114.3
LYS	168	8	114.3
TRAF	168	8	114.3
PHE	168	8	114.3
PROFI	168	8	114.3
SER	168	8	114.3
THR	168	8	114.3
VAL	168	8	114.3
TRP	168	8	114.3
TYR	168	8	114.3
LEU	140	8	137.1
CYS	168	8	114.3
Steriles deionisiertes Wasser			91.4

Tabelle 2: Komponenten des optimierten zellfreien Reaktions-Mastermixes von V. natriegens für das DNA-Template

Zellfreier Reaktions-Mastermix
Bestandteil	Bestandskonzentration (mM)	Endkonzentration (mM)	Menge (μL) 1x Reaktion	Menge (μL) 50x Reaktionen
Extrakt (%)		25	2.50	125.00
Mg-Glutamat	100	3.5	0.35	17.50
K-Glutamat	2000	80	0.40	20.00
4x Aminosäure-Mastermix	8.0	2	2.50	125.00
10x Mastermix für Energielösungen			1.00	50.00
Plasmid-DNA (ng/μL)	1000	500	0.50	25.00
50 % PEG-8000 (%)	50	2	0.40	20.00
T7-RNA-Polymerase			1.00	50.00
RNase-Inhibitor, Maus			0.10	5.00
Steriles deionisiertes Wasser			1.25	62.50
Reaktionsvolumen (μL):	10

Materialien