Echtzeit-Überwachung des Bakterienwachstums mit einem mikrofluidischen Mikrotröpfchenkultursystem

Zusammenfassung

Quelle: Jian, X. et. al., Automatisierte mikrobielle Kultivierung und adaptive Evolution mit dem mikrobiellen Mikrotröpfchenkultursystem (MMC). J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt den Einsatz einer mikrofluidischen Tröpfchen-basierten Plattform zur Echtzeitüberwachung des Bakterienwachstums. Durch die Erzeugung einheitlicher Tröpfchen, die Bakteriensuspensionen enthalten, und deren Führung durch einen Nachweisweg ermöglicht das System eine kontinuierliche optische Messung der Zelldichte, um eine Wachstumskurve zu erstellen.

Protokoll

1. Vorbereitungen

1. Verbinden Sie die Spritzennadel (Innendurchmesser beträgt 0,41 mm und der Außendurchmesser 0,71 mm), den Schnellanschluss A und die Reagenzflasche (Abbildung 1C) und autoklavieren Sie sie 15 Minuten lang bei 121 °C.
   ANMERKUNG: Schrauben Sie den Deckel der Reagenzflasche während der Sterilisation leicht ab. Jedes Mal können einige Reagenzflaschen mehr für den Gebrauch vorbereitet werden.
2. Verwenden Sie einen 0,22-μm-Filter für Polyvinylidenfluorid (PVDF), um das Öl des Mikrotröpfchenkultursystems (MMC) zu filtern. Legen Sie den Mikrofluidik-Chip (Abbildung 1B) und das MMC-Öl vorab in die Reinbank und sterilisieren Sie sie vor der Verwendung 30 Minuten lang durch ultraviolette Bestrahlung.
   ANMERKUNG: Einzelheiten zum Schnellanschluss A, zur Reagenzflasche, zum MMC-Öl und zum mikrofluidischen Chip finden Sie in der Materialtabelle.
3. Installieren Sie den Mikrofluidik-Chip
   1. Öffnen Sie die Tür der Operationskammer (Abbildung 1A), und heben Sie die Lichtwellenleitersonde an.
   2. Richten Sie die Löcher für das elektrische Feld an den Nadeln des elektrischen Feldes aus und platzieren Sie den Chip vorsichtig auf dem Chipsockel. Führen Sie dann die beiden Positioniersäulen in die Positionierlöcher ein und setzen Sie die Lichtwellenleitersonde ab (Abbildung 1D).
   3. Verbinden Sie den Schnellstecker A auf dem Chip mit dem entsprechenden Port der MMC entsprechend der Positionsnummer (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Schließen Sie dann die Tür der Operationskammer.
4. Füllen Sie das MMC-Öl (auf ca. 80 mL) in der Ölflasche auf und entleeren Sie die Abfallflüssigkeit vor der Verwendung in der Abfallflasche.
   ANMERKUNG: Bei der Abfallflüssigkeit handelt es sich in der Regel um organischen Abfall. Bitte beachten Sie bei der Entsorgung die regionalen Gesetze und Vorschriften, Änderungen je nach Versuchsaufbau vorbehalten.

2. Messung der Wachstumskurve in MMC

1. Vorbereitung für die bakterielle Erstlösung
   1. Befolgen Sie die entsprechenden Normvorschriften, um das Luria-Bertani (LB) Medium zuzubereiten und 15 Minuten lang bei 121 °C zu autoklavieren.
      ANMERKUNG: Bestandteile des LB-Mediums: NaCl (10 g/L), Hefeextrakt (5 g/L) und Trypton (10 g/L).
   2. Nehmen Sie den Stamm Escherichia coli (E. coli) MG1655 aus dem Glycerinbestand und kultivieren Sie ihn in einem 50-ml-Schüttelkolben mit 10 mL LB-Medium in einem Schüttelinkubator (200 U/min) bei 37 °C für 5-8 h.
      ANMERKUNG: Die Kultivierungszeit hängt von den jeweiligen Stämmen ab. Es ist optimal, den Stamm in der logarithmischen Periode/Phase zu kultivieren.
   3. Verdünnen Sie die kultivierte E. coli MG1655-Lösung mit frischem Medium auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern (OD₆₀₀) von 0,05-0,1, um eine anfängliche bakterielle Lösung zu erhalten (bereiten Sie etwa 10 ml vor).
2. Klicken Sie auf Initialisierung , um die MMC zu initialisieren. Nachdem die Initialisierungsschnittstelle angezeigt wird, stellen Sie die Kultivierungstemperatur auf 37 °C und den Wert des photoelektrischen Signals auf 0,6 ein (Abbildung 2A). Die Initialisierung dauert ca. 20 Minuten.
3. Schalten Sie die UV-Lampe (Wellenlänge 254 nm) während der Initialisierung ein.
4. Injizieren Sie die anfängliche Bakterienlösung und das MMC-Öl in die Reagenzflasche.
   1. Nehmen Sie eine sterilisierte Reagenzflasche aus der Reinbank und ziehen Sie die Kappe fest.
   2. Verwenden Sie eine sterile 10-ml-Spritze, um 3-5 ml MMC-Öl aus der Spritzennadel des Seitenschlauchs zu injizieren. Kippen und drehen Sie die Reagenzflasche langsam, damit das Öl vollständig in die Innenwand eindringt.
   3. Injizieren Sie etwa 5 ml der anfänglichen Bakterienlösung und füllen Sie dann die Reagenzflasche, indem Sie erneut 5-7 ml des Öls injizieren.
   4. Ziehen Sie den unabhängigen Schnellanschluss A heraus und stecken Sie den Schnellanschluss A der Reagenzflasche in den Schnellanschluss B, um den Probeninjektionsvorgang abzuschließen (Abbildung 3A).
5. Warten Sie, bis die Initialisierung abgeschlossen ist, und schalten Sie dann die UV-Lampe (Wellenlänge 254 nm) aus.
6. Öffnen Sie die Tür der Operationskammer und stellen Sie die Reagenzflasche in das Metallbad.
7. Ziehen Sie den C2-Stecker des Chips und den Schnellanschluss A der Reagenzflasche heraus. Verbinden Sie den Seitenrohranschluss der Reagenzflasche mit dem C2-Anschluss und den Oberrohranschluss mit dem O2-Anschluss. Schließen Sie dann die Tür der Operationskammer.
8. Klicken Sie auf Wachstumskurve , um die Funktion der Wachstumskurvenmessung auszuwählen (Abbildung 2A). Geben Sie in der Parametereinstellungsschnittstelle die Zahl als 15 ein, schalten Sie den OD-Erkennungsschalter ein und stellen Sie die Wellenlänge auf 600 nm ein. Klicken Sie auf Start , um die Tröpfchengenerierung zu starten. Die Fahrt dauert ca. 10 Minuten. ANMERKUNG: Hier bezieht sich Zahl auf die Anzahl der zu erzeugenden Tröpfchen. Die Wellenlänge bezieht sich auf die Wellenlänge des zu detektierenden OD. Stellen Sie die Anzahl (maximal 200) und die Wellenlänge (350-800 nm) entsprechend den Anforderungen des Experiments ein.
9. Wenn auf der Hauptschnittstelle ein Popup-Fenster mit der Aufforderung "Entfernen Sie die Reagenzflasche zwischen C2 und O2, dann klicken Sie bitte nach Abschluss auf die Schaltfläche OK" angezeigt wird, öffnen Sie die Tür der Operationskammer, um die Reagenzflasche herauszunehmen und die C2- und O2-Anschlüsse anzuschließen.
10. Schließen Sie die Tür und klicken Sie im Popup-Fenster auf die Schaltfläche OK , um die Tröpfchen automatisch zu kultivieren und die OD-Werte zu erkennen.
    ANMERKUNG: Die MMC erkennt den OD-Wert, wenn das Tröpfchen die Lichtwellenleitersonde passiert. Daher hängt die Nachweisdauer von der Anzahl der erzeugten Tröpfchen ab.
11. Wenn die Wachstumskurve die stationäre Phase erreicht, klicken Sie auf die Schaltfläche Datenexport , um die OD-Daten zu exportieren. Wählen Sie den Datenspeicherpfad aus und exportieren Sie den während der Kultivierungszeit aufgezeichneten OD-Wert in das Format .csv, das mit einer entsprechenden Software (z. B. Microsoft Excel) geöffnet werden kann. Verwenden Sie dann eine Mapping-Software (z. B. EXCEL und Origin 9.0), um die Wachstumskurve darzustellen.
    ANMERKUNG: Während des Kultivierungsprozesses ist es jederzeit möglich, auf den Datenexport zu klicken, um die OD-Daten aller aktuellen Tröpfchen zu exportieren.

Ergebnisse

Abbildung 1: Aufbau und wesentliche Werkzeuge der MMC. (A) Externe und operative Kammer des MMC. (B) Der mikrofluidische Chip von MMC. Der Chip verfügt über sieben Kanäle (C1-C6 und CF). (C) Reagenzflasche. Es verfügt über ein Oberrohr und ein Seitenrohr....

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,22 μm PVDF-Filtermembran	Merck Millipore AG	SLGPR33RB	Sterilisieren Sie das MMC-Öl
4 °C Kühlschrank	Haier	BCD-289BSW	Für die Lagerung von Reagenzien
Agar	Becton, Dickinson und Co.	214010	Für die Vorbereitung von massiven Platten
Saubere Bank	Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.	DL-CJ-INDII	Für den aseptischen Betrieb und die UV-Sterilisation
Computer	Lenovo (Englisch)	Nr. E450	Softwareinstallation und MMC-Steuerung
Inkubator mit konstanter Temperatur	Shanghai qixin scientific instrument co., LTD	LRH 250	Für die mikrobielle Kultivierung mit festem Medium
Elektronische Waage	OHAUS	AR 3130	Zum Wiegen von Reagenzien
EP-Rohr	Thermo Fischer	1,5 mL	Für die Tröpfchensammlung
Gefrier-Röhrchen	Thermo Fischer	2,0 mL	Zur Erhaltung der Dehnung
Glycerin	ALLGEMEINES REAGENZ	G66258A	Zur Erhaltung der Dehnung
Hochdruck-Dampfsterilisationstopf	SANYO Elektrisch	MLS3020	Für die autoklavierte Sterilisation
Mikrobielles Mikrotröpfchen-Kultursystem (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-I	Durchführung der Wachstumskurvenbestimmung und adaptiven Evolution. Bitte beachten Sie http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Mikrofluidischer Chip	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	Für verschiedene Tröpfchenoperationen. Bitte beachten Sie http://www.tmaxtree.com/en/
MMC-Öl	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	Die Ölphase für die Tröpfchen-Mikrofluidik. Bitte beachten Sie http://www.tmaxtree.com/en/
NaCl	ALLGEMEINES REAGENZ	G81793J	Bestandteil des LB-Mediums
Petrischale	Corning Incorporated	90 mm	Für die Aufbereitung von Feststoffen
Pipette	Eppendorf	2,5 μL, 10 μL, 100 μL, 1000 μL	Für das Liquid Handling
Schnellkupplung A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	—	Für die Verbindung jedes Gelenks. Bitte beachten Sie http://www.tmaxtree.com/en/
Reagenzflasche	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-Leiterplatte	Probenahme und Lagerung von Bakterien, Lösung und Reagenzien. Bitte beachten Sie http://www.tmaxtree.com/en/
Flasche schütteln	Union-Biotech	50 mL	Für die mikrobielle Kultivierung
Inkubator zum Schütteln	Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.	SKY-210 2B	Für die mikrobielle Kultivierung in Schüttelkolben
Spritze	JIANGSU ZHIYU MEDIZINISCHE ANLEITUNG CO., LTD	10 mL	Ziehen Sie Flüssigkeit und injizieren Sie sie in die Reagenzflasche
Spritzennadel	OUBEL Baumarkt	22G	Der Innendurchmesser beträgt 0,41 mm und der Außendurchmesser 0,71 mm.
Trypton	Oxoid GmbH	Nr. LP0042	Bestandteil des LB-Mediums
Ultra-Tieftemperatur-Kühlschrank	SANYO Ultra-niedrig	MDF-U4086S	Zur Erhaltung der Dehnung (-80 °C)
UV-Vis-Spektralphotometer	General Electric Unternehmen	Ultrospec 3100 pro	Zur Messung von OD-Werten
Hefeextrakt	Oxoid GmbH	Nr. LP0021	Bestandteil des LB-Mediums