Natürliche Transformation und GFP-Expression in der filamentösen Cyanobakterium Phormidium lacuna

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Weber, N., et al., Natürliche Transformation, Proteinexpression und Kryokonservierung des filamentösen Cyanobakteriums Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video beschreibt ein Verfahren zur Durchführung einer natürlichen Transformation in filamentösen Cyanobakterien unter Verwendung von Plasmid-DNA, um eine stabile GFP-Expression und Antibiotikaresistenz durch homologe Rekombination zu erreichen.

Protokoll

1. Natürliche Transformation und GFP-Expression

ANMERKUNG: Die Transformation basiert auf einem Plasmidvektor, der in Escherichia coli (E. coli) vermehrt wird; pGEM-T oder pUC19 können als Rückgratvektoren verwendet werden. Beispiele für Vektoren für die Expression von grün fluoreszierenden Superfolder-Proteinen (sfGFP) sind im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" beschrieben.

Führen Sie alle Schritte mit sterilem Material unter sterilen Laborbedingungen (Reintisch, sterile Glaswaren) durch.
Beimpfen Sie 2 x 50 mL f/2 Flüssigmedium in zwei 250 mL Kolben mit 2 x 1 mL Phormidium lacuna (P. lacuna) Filamenten aus einer Laufkultur. Anbau bei weißem Licht (50 μmol ^m-2 ^s-1) unter Rühren (horizontale Rotation, 50 U/min) für ~5 Tage bei 25 °C.
Bereiten Sie ~200 μg der Transformationsvektor-DNA mit einem Midi-Prep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
Homogenisieren Sie 100 mL P. lacuna-Zellsuspension (siehe Materialtabelle) bei 10.000 U/min für 3 Minuten. Messen Sie den Außendurchmesser bei 750 nm (gewünschter Wert = 0,35).
Die Zellsuspension wird 15 min lang bei 6.000 × g zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 800 μL (Gesamtvolumen einschließlich Restflüssigkeit und Filamenten) der restlichen Flüssigkeit und zusätzlichem f/2⁺ Medium.
Nehmen Sie acht f/2⁺ Bacto-Agar-Platten (10 cm Durchmesser) mit 120 μg/mL Kanamycin. Pipettieren Sie 10 μg DNA in die Mitte jeder Agarplatte. Pipettieren Sie sofort 100 μl Zellsuspension in die Mitte jeder Agarplatte (auf der DNA).
Bewahren Sie die Agarplatte ohne Deckel auf der Reinbank auf, damit die überschüssige Flüssigkeit verdampfen kann. Verschließen Sie die Platte und kultivieren Sie sie 2 Tage lang bei weißem Licht bei 25 °C.
Verteilen Sie die Filamente jeder Agarplatte mit einer Impfschlaufe auf mehrere frische f/2⁺ Bacto-Agar-Platten mit 120 μg/mL Kanamycin. Kultivieren Sie die Platten in weißem Licht bei 25 °C und kontrollieren Sie die Kulturen regelmäßig unter dem Mikroskop.
Identifizieren Sie lebende, transformierte Filamente nach 7-28 Tagen unter dem Mikroskop. Suchen Sie nach gesunden, grünen Filamenten (Abbildung 1), die sich von anderen Filamenten unterscheiden. Wenn diese grünen Filamente identifiziert werden können, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Andernfalls bewahren Sie die Platte weitere 7 Tage auf.
Verwenden Sie eine Pinzette, um diese identifizierten lebenden Filamente in 50 mL flüssiges f/2⁺ Medium mit 250 μg/mL Kanamycin zu übertragen. Anbau bei weißem Licht bei 25 °C auf einem Shaker (horizontale Drehung, 50 U/min). Beobachten Sie das Wachstum bis zu vier Wochen lang.
Übertragen Sie die Filamente zurück in ein Agarmedium mit 250 μg/mL Kanamycin und warten Sie, bis die Filamente gewachsen sind. Nach einigen Tagen werden einzelne Filamente auf eine frische Agarplatte mit einer höheren Konzentration an Kanamycin, z. B. 500 μg/ml, übertragen. Bewahren Sie die Originalplatte auf.
Stellen Sie sicher, dass die Filamente in einer hohen Konzentration von Kanamycin in Flüssigkultur oder auf Agar vermehrt werden. Erhöhen Sie die Kanamycin-Konzentration erneut, um die Entmischung zu beschleunigen. ANMERKUNG: Transformiertes P. lacuna wächst in bis zu 10.000 μg/ml Kanamycin. Andere Spezies vertragen solche hohen Konzentrationen möglicherweise nicht.
Für die GFP-Expression: Betrachten Sie einzelne Filamente mit einem Fluoreszenzmikroskop bei einer auf 40x oder 63x eingestellten Vergrößerung des Objektivs. Nehmen Sie ein Hellfeld-Transmissionsbild und ein Fluoreszenzbild auf. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für GFP: 470 nm Bandpass für die Anregung, 525 nm Bandpass für die Emission und ein 495 nm Strahlteiler, anfängliche Belichtungszeit von 500 ms.
Passen Sie die Belichtungszeit für klare Fluoreszenzsignale an, um Sättigungsintensitäten zu vermeiden. Versuchen Sie, für alle Samples die gleiche Einstellung zu verwenden.
Da die Wildtyp-Filamente ebenfalls Fluoreszenz anzeigen, nehmen Sie Bilder mit den gleichen Einstellungen wie oben für diese Hintergrundfluoreszenz auf.HINWEIS: Der Stamm, der GFP exprimiert, muss ein höheres Signal haben; andernfalls drückt es kein GFP aus.
Berechnen und vergleichen Sie anhand der Belichtungszeiten und der Pixelintensitäten der Fluoreszenzbilder den GFP-Gehalt der verschiedenen Filamente.

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Ergebnisse

Abbildung 1. Phormidium lacuna Filamente 5 Wochen nach der Transformation. Es wurde der sfGFP-Expressionsvektor pMH1 verwendet; Die Selektion erfolgte auff/2-Medium mit 120 μg/mL Kanam...