Erzeugung von magnetit-eingebetteten bakteriellen Nanocellulose-Pellikeln

Zusammenfassung

Quelle: Arias, S. L., et al. Herstellung einer funktionalisierten magnetischen bakteriellen Nanocellulose mit Eisenoxid-Nanopartikeln. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert die In-situ-Synthese von Magnetit-Nanopartikeln in einem bakteriellen Nanocellulose-Pellikel, das von Gluconacetobacter xylinus produziert wird. Es erklärt, wie magnetische bakterielle Nanocellulose durch Eisenioneninfusion, alkalische Fällung und Reinigung erzeugt wird.

Protokoll

1. Synthese polymerbeschichteter Eisenoxid-Nanopartikel und deren Ablagerung in einer bakteriellen Nanocellulosemembran (BNC)

1. Blasen Sie 1.000 ml hochreines Wasser mit Stickstoffgas, um gelösten Sauerstoff aus dem Wasser zu entfernen und durch Stickstoff zu ersetzen.
2. Verwenden Sie eine dreihalsige Rundbodenflasche, um eine Lösung im 2:1-Molarverhältnis von Eisen (III) Chloridhexahydrat (FeCl_{3,6H 2}O) und Eisenchloridtetrahydrat (FeCl 2,4H₂O) herzustellen, verdünnt mit sauerstoffarmem, hochreinem Wasser. Zum Beispiel verwenden Sie 5,4 g FeCl 3,6H ₂O und 1,98 g FeCl 2,4H₂O in 10 ml sauerstoffarmen, hochreinen Wasser. Wenn diese Zubereitung zu zähflüssig und schwer rührbar wird, verwenden Sie 0,54 g FeCl_{3,6H 2}O und 0,198 g FeCl 2,4H₂O in 20 ml sauerstoffarmes, hochreines Wasser.
   ANMERKUNG: Reduzieren Sie die Expositionszeit des FeCl₂·4H₂O gegenüber der Luft, indem Sie diese chemische Verbindung so schnell wie möglich wiegen. Sobald er in den dreihalsigen rundbodenigen Kolben eingeführt ist, schließen Sie den dreihalsigen runden Kolben mit Septumstopfen, bis er mit der Stickstoffgasversorgung und dem Kondensatorrohr verbunden ist.
3. Verwenden Sie zwei Hals des Gefäßes, um einen konstanten Ein- und Austritt von Stickstoffgas zu gewährleisten, indem Sie die Stickstoffgasversorgung an eine Nadel anschließen, die in einem Septum-Stopper gesteckt und an den Hals des Gefäßes befestigt ist.
4. Setzen Sie 1 BNC-Pellicle (15,6 mm Durchmesser und 2–3 mm Dicke) zusammen mit den Reaktanten in das Gefäß. Stellen Sie sicher, dass die Probe vollständig in der Flüssigkeit untergetaucht ist.
5. Verbinden Sie den verbleibenden Hals des Gefäßes mit einem Kondensatorrohr. Zusätzlich verwenden Sie ein Trocknungsrohr mit wasserfreiem Calciumsulfat auf dem Kondensatorrohr. Führe Wasser durch das Kondensatorrohr.
6. Dichten Sie alle Glasverbindungen mit Vakuumfett ab.
7. Erhitze die Lösung in einem Silikonölbad auf 80 °C mit einer Rührplatte und halte diese Temperatur bis Schritt 1,10. Verwende eine kleine magnetische Rührstange, um die Reaktanten bei 350 U/min 5 Minuten lang zu mischen. Stellen Sie sicher, dass das BNC angemessen mit der eisenhaltigen Lösung imprägniert ist und die Reaktanten vollständig aufgelöst sind. Rühre die Mischung weiter bis zum Ende des Experiments.
   ANMERKUNG: Verwenden Sie ein Thermometer, um die Temperatur des Silikonöls zu überprüfen. Es sollte bis zu 80 °C stabil sein.
8. Erhöhen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 700 U/min und geben Sie (durch Tropfen) in einem Zeitintervall von 5 Minuten 5 ml Ammoniumhydroxid (NH₄OH, 14 %) mit einer Pipettennadel zu der 10 ml Eisenlösung, die ebenfalls in einen Septum-Stopper eingestanzt wurde. Nach der Zugabe des Ammoniumhydroxids ändert sich die Farbe der Lösung von gelb/orange zu schwarz.
9. Rühre die Lösung weitere 5 Minuten bei 80 °C weiter um. Vermeiden Sie Hochgeschwindigkeitsrührungen, um die Integrität der Probe zu erhalten. Hohe Geschwindigkeiten, also höher als 1.000 U/min, können die Probe zerstören.
10. Senke die Temperatur der Lösung auf 30 °C mit dem Temperaturreglerunterboden der Rührplatte und rühre weitere 5 Minuten weiter. Dann schalte die Kochplatte aus. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Eisenoxid-Nanopartikel (IONPs) in das BNC-Netz integriert.
11. Kühlen Sie das Gemisch auf Raumtemperatur (RT) ab und trennen Sie die magnetischen Nanopartikel (MNPs) und BNC mit einem starken Permanentmagneten (z. B. 1 Tesla). Dazu überträgt man die Mischung in eine Gefäßflasche und hält dann, während der Magnet nahe am Gefäß bleibt, die MNPs und das BNC an Ort und Stelle, während das Supernatant dekantiert wird.
    Anmerkung: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit starken Magneten, da sie bei falscher Anwendung schädlich sein können. Für die Schritte (1.12) - (1.14) und (1.16) verwenden Sie das zuvor in (1.1) zubereitete deoxygenierte, hochreine Wasser, um eine Oxidation der Partikel zu verhindern.
12. Suspendieren Sie die MNPs und BNC erneut in 100 ml Wasser. Schütteln Sie die Lösung sanft, um alle MNPs zu entfernen, die nicht stark in den BNC integriert sind. Dekantieren Sie das Supernatant erneut, indem Sie die MNPs und den BNC mit dem Magneten festhalten.
13. Waschen Sie die MNPs und das BNC mehrmals mit Wasser, bis das Überlagerungsmittel einen neutralen pH-Wert (pH~7) erreicht, gemessen mit einem kolorimetrischen Streifen.
14. Trennen Sie das magnetisch funktionalisierte BNC oder magnetische bakterielle Nanocellulose (MBNC) mit einer Pinzette von den MNPs und spülen Sie das MBNC mehrmals mit Wasser, bis das Wasser klar ist.
15. Sterilisieren Sie das MBNC, indem Sie das MBNC O/N UV (110–280 nm) aussetzen.
16. Autoklaven: 500 ml sauerstofffreies, hochreines Wasser bei 120 °C für 20 Minuten und lagern Sie das MBNC in 20 ml dieses Wassers.
17. Aseptisch wird die Probe in 1 % Polyethylenglykol (PEG) eingetaucht und 2 Stunden bei RT (37 °C) umgerührt. Dieses Verfahren verbessert die Biokompatibilität und Stabilität der im BNC abgelagerten Eisenoxid-Nanopartikel, insbesondere der an der Oberfläche freiliegenden Partikel. Die PEG-Beschichtung wird über das MBNC 3D-Netzwerk verteilt.
    ANMERKUNG: Nackte IONPs werden in der Luft aufgrund ihrer hohen chemischen Aktivität leicht oxidiert. Obwohl PEG als nicht biologisch abbaubares Material gilt, hängt seine chemische Stabilität von den angewandten biologischen Bedingungen wie Wassergehalt, pH-Wert, Temperatur, Enzymen, reaktiven Sauerstoffspezies, reaktiven Stickstoffspezies und anderen ab.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Glucoacetobacter xylinus	ATCC	700178
Eisen(III)chlorid-Hexahydrat	Sigma Aldrich	236489-100G
Ammoniakwasser	Macron Feinchemikalien	6665-46
Poly(Ethylenglykol), durchschnittlich 400 Mn	Sigma Aldrich	202398-250G
Eisen(II)chlorid-Tetrahydrat	Sigma Aldrich	44939-250G
Wasserfreies Calciumsulfat	W.A. Hammond Drierite	13001
Hochvakuumfett	Sigma Aldrich	Z273554-1EA
pH-Teststreifen	Sigma Aldrich	P4786-100EA
Rundboden-Dreihals-Winkel-Destillationskolben	Sigma-Aldrich	CLS4965250
Silikonöl für Ölbäder	Sigma-Aldrich	85409-250ML
Trocknungsrohr	Chemglas	CG-1295-01
Septum-Stopper, Sleeve-Typ	Chemglas	CG-3022-98
Magnetischer Rührstab	Chemglas	CG-2001-05
Kondensator	Chemglas	CG-1218-01
Temperaturregler	BriskHeat	SDC120JC-A
Rührplatte	Fisher Scientific	11-100-49SH